专家经验谈：如何用CRISPR编辑iPS细胞（下）

生物通报道：CRISPR基因编辑和iPS重编程是生命科学领域近十年最热门的两大技术。现在，科学家们正在撮合它们联姻。人们普遍认为，iPS与CRISPR的结合会起到一加一大于二的效果。举例来说，CRISPR用于人类iPSC可以揭示基因在特定疾病中所起的作用，甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。虽然CRISPR-Cas9和人类iPSC在实验室中已经相当普及了，但二者相结合并没有想象中那么容易。The Scientist杂志与多位正在使用这两个工具的专家联系，推出了在人类干细胞中使用CRISPR的基础指南。这份指南对人iPSC和人胚胎干细胞同样适用。

上接：专家经验谈：如何用CRISPR编辑iPS细胞（上）

敲除VS精确编辑

当你用CRISPR-Cas9切割基因的时候，主要有两个分子通路在执行DNA修复。这两个同时发生的通路决定了基因编辑的精确性。非同源末端连接（NHEJ）负责敲除基因，制造破坏基因功能的小插入/缺失。同源介导修复（HDR）根据供体DNA精确改变核苷酸序列。

不少研究者在进行基因组编辑的时候使用偏向HDR的条件。他们发现，人多能干细胞的编辑效果比传统永生细胞系差，转染100个iPSC只能引入一个正确的改变。这是CRISPR基因组编辑面临的一个主要挑战，不过Hockemeyer觉得自己的团队还能应付。“如果你有很好地组织培养流程，那么挑200个克隆就能获得2个正确克隆。一个学生在三小时内就能搞定，”他介绍道。

Hockemeyer及其同事正在开发新策略，试图让天平向HDR倾斜，比如采用特殊化合物或者其他物种的Cas9。“我认为这个问题很可能未来几年内就能得到解决，”Hockemeyer表示。

Conklin团队开发了一种快速数字PCR测试，用来定量HDR和NHEJ的修复效率。他们的研究显示，在人iPSC和其他一些细胞中，HDR和NHEJ效率之间并没有什么关系。

验证你的基因组编辑

如何证明CRISPR系统完成了正确的切割呢？你可以给细胞提供与编辑基因互补的DNA，这些DNA应该能够挽救相应的细胞表型。如果细胞表型变化很小难以观察，你可以尝试再次编辑这个基因，看看能否使其恢复成野生型，Hocke­meyer说。

研究者们也会抽查自己的基因组，比如对编辑区域进行PCR和Sanger测序。免费算法TIDE（tide.nki.nl/; for Tracking of Indels by DEcomposition）可以在PCR和Sanger测序数据的基础上鉴定目标突变及其发生的频率。

外显子组测序将成为验证基因组编辑的首选方法。“测序可能是对你整个系统最完全的分析。如果这个细胞系要用上十年，那么测序就是你应该做的投资。你需要确保一切都尽善尽美，”Mali指出。同时我们也应当请牢记，遗传学差异会随着时间的推移慢慢累积，任何细胞系都不例外。

脱靶效应并非大问题

针对同一个位点设计两个以上有充分差异的向导RNA，这是防止脱靶编辑一个主要途径。总的来说，脱靶效应对于绝大多数基础研究者来说并不是什么特别大的问题，Cowan认为。CRISPR系统在人多能干细胞中的脱靶效应比癌细胞系少得多，Cheng也表示。但如果真的很担心脱靶，全外显子测序将是你最好的选择。

用CRISPR调控基因表达

如果你指望在多能干细胞中敲除多能性必需基因，那你肯定要失望了。因为敲除这些基因会导致细胞死亡。在这种情况下，我们只能选择下调（或上调）基因的表达水平。研究者们为此打造了失去催化活性的dCas9，dCas9能到达向导RNA指定的位点，但无力对DNA进行剪切。用dCas9抑制转录的策略被称为CRISPRi，用dCas9激活转录的策略被称为CRISPRa。

今年三月Cell Stem Cell杂志发表的一项研究显示，对iPSC进行功能缺失筛选的时候，CRISPRi比传统CRISPR更为有效。CRISPRi在95%的细胞中沉默目的基因，CRISPR-Cas9只能在60-70%的细胞中关闭目的基因，而且CRISPRi没有发生脱靶。（更多详细信息参见：华人学者齐磊：比CRISPR-Cas9更优的CRISPRi）

基因表达控制和基因编辑之前的主要区别在于，基因表达控制并非永久性改变基因组。你可以干扰细胞沉默基因，然后再逆转这种抑制。此外，与CRISPR-Cas9相比，CRISPRi和CRISPRa的脱靶效应更小。

CRISPR调控基因表达也存在一定的挑战。举例来说，设计一组可靠的向导RNA很难，Mali说。在理想情况下，向导RNA应当避开紧紧缠绕核小体的基因组区域。但有时候我们想要靶标的位点就在这些区域里。

将CRISPRa和CRISPRi送入人多能干细胞也比较复杂。“使CRISPRa和CRISPRi进入70-80%的细胞依然很难，除非你使用病毒来递送。通常我们说的都是30-40%的细胞，”Cowen指出，他正在用CRISPRa激活和验证报告基因。这种方法对他很有帮助，因为iPSC很难分化成他想要的肾内皮细胞。

我们基因组的80%会转录成RNA，但这些转录本大多不生成蛋白质。近年来人们发现非编码RNA往往与人类疾病有关，不过绝大多数非编码RNA的功能还是未知的。CRISPRa和CRISPRi特别适合分析非编码RNA的具体功能。前不久，The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南，帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。（更多详细信息参见：CRISPR功能研究入门指南）

在CRISPR系统的基础上使用sgRNA文库进行遗传筛选，是鉴定基因调控子的一种有效方法。研究者们可以通过CRISPR筛选在基因组非编码区域中寻找功能性元件。不过这样的应用需要高度覆盖又简单实用的自定义sgRNA文库。耶鲁大学医学院的研究人员开发了一个名为Molecular Chipper的新技术。该技术能够针对指定基因组区域生成密集覆盖的sgRNA文库。（更多详细信息参见：武大学子开发CRISPR新技术探索非编码区域）

生物通编辑：叶予

生物通推荐原文：Using CRISPR to Edit Genes in Induced Pluripotent Stem Cells