实时无标记3D全息成像量化分析技术与质谱分析整合

带来与众不同的单细胞研究视野

瑞士Nanolive公司于2015年推出的独创技术：全息断层扫描无标记3D成像技术3D Cell Explorer，整合全息成像与360度旋转光源断层扫描技术为一体，以无标记非侵入式的成像方式，高达75nm的极限分辨率，实时构建细胞全息3D成像。这种技术与质谱分析整合，带来与众不同的单细胞研究视野。

细胞作为最小的生命结构单元之一，对于生物体功能的正常发挥起着重要作用，长久以来，研究工作者一直在寻找新的分析方法和技巧从事细胞簇、单细胞、亚细胞的研究。近年来，在样品获取、细胞操纵、细胞内容物的测量及细胞间动力学过程等方面都取得了很大进展，单细胞分析已经成为分析化学一个重要的研究内容，除了大量的研究报告之外，已经有了自己的专业会议论坛，如德国Münste的单细胞测量会议。

不同的细胞个体之间具有差异性，为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用，就必须从单细胞水平上对细胞中物质的组成和含量进行分析研究。但是单细胞分析研究却由于细胞的体积极小、物质的种类极多、物质的含量极少以及不同物质间显著的浓度差异而一度受阻。质谱是一种很适合于单细胞分析的检测方法，它具有极高的灵敏度、多物质同时检测的能力以及对所感兴趣的分子进行结构鉴定的能力。

回顾目前研究领域内单细胞的分离与研究方法，从传统的手工或流式分选到成熟的微流控芯片技术。从C1单细胞自动制备系统到单细胞基因组分析，再到单细胞质谱分析，这些方法各有特点，但都是对单个细胞的总体分析，然而细胞除了整体的差异，因其还是一个生命体，处于不断的运动状态，在不同时期，不同部位，细胞的组分也是不同的，传统技术对细胞局部微小差异的改变、体积及定位很难检测到，由瑞士Nanolive公司在Nature杂志（Nature，20 JANUARY 2013 | DOI: 10.1038/NPHOTON.2012.329）发表的研究成果，并于2015年推出的独创技术：全息断层扫描无标记3D成像技术3D Cell Explorer，整合全息成像与360度旋转光源断层扫描技术为一体，以无标记非侵入式的成像方式，高达75nm的极限分辨率，实时构建细胞全息3D 成像，基于折射率的任意数字染色，其创新研究应用成果成功在Nature上发表。

创新技术应用回望：Nanolive与质谱分析联用

1、代谢组学研究：小分子，单细胞（Nature，December 2016，VOL 540.153）

2016年10月，日本RIKEN定量生物学中心的化学家Tsutomu Masujima在Nature杂志上发表了Nanolive在细胞体积及定位追踪与单细胞质谱在代谢组学中的应用，其为了研究细胞不同时期代谢组分的变化需要取不同时期的细胞内含物上质谱分析，但因取样量很少，细胞体积变化甚微，更不好对取样进行定位，无法知道每次取样量是多少，借助Nanolive的3D 细胞全息构建与精确的细胞体积及定位计算，2s实现 3D 成像与重构的超高速度，分析取样前后细胞形变计算细胞质体积变化，从而精确推断出每次取样体积，与质谱分析结果精确对应，利用这种方法，对代谢组物如蛋氨酸亚砜的采样可达5.9 zeptomoles，将质谱分析的应用扩展到更深层的微体积浓度及定位，以更加精确的方式揭示外界环境，药物等在代谢组学中的作用机理。

2、3D全息和断层扫描激光显微镜通过空间评估量化单细胞质谱检测（Analytical sicences，February 2016,vol.32）

本研究在全息及断层3D扫描显微镜下观测了单个HepG2细胞内含物的体积及位置，无需标记，通过折射率进行数字染色；通过活性单细胞质谱仪进行定量，单个活细胞质谱分析仪能够通过纳米喷嘴头吸取皮升级的细胞内含物，之后给喷嘴头施加电压就可送入质谱仪分析了，但是这种方法对吸取的确切量并不清楚，因为体积太小；进一步的3D空间定位及内含物的鉴定也是模糊不清的。通过与Nanolive的无标记全息断层扫描技术结合，提供更高的空间分辨率（xy轴为0.18um，z轴0.33um）；对比吸样前后的HepG2细胞3D全息断层扫描细胞图像，可以推断精确的吸样体积和捕获的细胞内含物的初始位置，预测捕获的分子总数 ；图像同样揭示了操作引起的在细胞结构中形态学的变化，可对质谱仪连用的纳米喷嘴吸头吸取的细胞内含物的位置及体积做精确分析，并可观察吸样前后线粒体、细胞核等变化，结合质谱仪对吸入的内含物成分的鉴定，可计算单位体积中3-羧基-月硅酸、6-丙醇酰-5,6,7四氢生物蝶呤等的含量，分析不同时间、不同细胞位置在不同外界条件、药物作用下等对细胞成分与细胞结构等变化的影响，这些变化可推广应用到细胞发育过程的研究，体外受精、细胞癌变等过程研究，以精准找到病变及药物作用机理，帮助揭示生命发生机制，开发有效的抗癌药物等。

 
图1.Nanolive 3D Cell Explore 与质谱，显微操作联用

   
图2.Nanolive 细胞体积检测与定位

技术创新点：
▪ 非侵入式或无需染色标记的纳米级3D 细胞结构成像
▪ 基于物理折射率的任意数字染色
▪ 无标记纳米级分辨率，极限高达75nm
▪ 超高速3D 成像：2秒钟96层断层扫描与3D全息影像呈现
▪ 可整合活细胞工作站，进行time-Lapse

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