同济大学教授利用CRISPR系统发现：一种具有双重作用的卵细胞成熟因子

　　

生物通报道：来自同济大学生命科学与技术学院，北京生命科学研究所等处的研究人员利用CRISPR/Cas9基因修饰系统构建了Sall4基因条件性敲除小鼠，从而发现SALL4能作为重要的转录因子和表观遗传调控因子参与卵母细胞成熟的调控机制。

这一研究成果公布在Journal of Biological Chemistry杂志上，研究人员应用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功得到了条件性基因敲除的小鼠（Sall4loxP/loxP）和基因荧光标记小鼠（Sall4-mCherry），为在卵母细胞中研究Sall4基因的功能创造了有利条件。

领导这一研究的是同济大学高绍荣教授，陈嘉瑜助理教授为共同通讯作者，第一作者为高绍荣教授课题组的硕士研究生许锴和陈霞。高绍荣教授主要研究领域为干细胞与体细胞重编程，利用体细胞核移植与诱导多能干细胞技术从事哺乳动物早期胚胎发育和体细胞重编程分子机制与干细胞研究。

卵细胞的成熟关系到受精和早期胚胎发育的顺利进行，是生殖医学领域最重要的研究方向之一。Sall4（Splat-like 4）在很多重要的生物学进程中起到关键作用，例如，参与胚胎干细胞的干性维持、细胞重编程、原始生殖细胞发育、精原干细胞的分化。2016年高绍荣课题组与中科院生物物理研究所朱冰课题组合作，在Molecular Cell杂志上，揭示了Sall4参与DNA羟基化的调控机制。

在这项研究中，研究人员首先利用CRISPR/Cas9基因修饰系统构建了Sall4基因条件性敲除小鼠，随后将这种小鼠与Zp3-Cre或Gdf9-Cre小鼠进行交配、繁殖和基因型筛选得到在卵母细胞中特异性敲除Sall4基因的母鼠。研究人员发现这种小鼠无法产生成熟的卵母细胞，并且这些敲除了Sall4的卵母细胞呈现出极低水平的DNA甲基化修饰和异常紊乱的组蛋白修饰水平（分别是高水平的H3K27me3修饰以及低水平的H3K4me3修饰）。

同时研究人员还发现SALL4能够调控与上述两种组蛋白修饰相关的酶——Kdm5b、Kdm6a和Kdm6b基因的表达。他们进一步通过体外mRNA和siRNA注射的方法证实了异常水平的H3K4me3和H3K27me3修饰会导致一些重要的与卵细胞成熟相关基因的异常表达，从而阐释了SALL4在卵母细胞的表观遗传成熟（epigeneticmaturation）上所起的重要作用。

这一研究首次观察到Sall4基因的敲除能够影响卵母细胞中DNA甲基化的建立，并且证明组蛋白修饰水平的稳定对卵母细胞的转录组稳定和进一步成熟具有不可或缺的作用。除此之外，研究者应用了CRISPR/Cas9基因编辑系统成功得到了条件性基因敲除的小鼠（Sall4loxP/loxP）和基因荧光标记小鼠（Sall4-mCherry），为在卵母细胞中研究Sall4基因的功能创造了有利条件。

另外研究应用了单细胞RNA-seq和单细胞RRBS等微量测序技术，从而解决了卵母细胞研究受制于细胞数量的问题。而且还应用了卵母细胞体外注射的方法，巧妙地验证了异常的组蛋白修饰对卵细胞成熟的重要作用。这些方法的应用，充分展现了新技术的产生和发展对生命科学研究的推动作用。

作者简介：

高绍荣
教育部“****”特聘教授、国家杰青获得者

研究领域： 干细胞与体细胞重编程
研究方向：1、体细胞重编程的分子机制
2、利用疾病特异iPS细胞研究疾病发生机制
3、哺乳动物早期胚胎发育的分子机制

研究方向与主要学术成就：

主要利用体细胞核移植与诱导多能干细胞技术从事哺乳动物早期胚胎发育和体细胞重编程分子机制与干细胞研究。与中科院动物研究所周琪实验室在2009年分别独立报道了iPS小鼠的研究成果，从而在世界上首次证明了iPS细胞的真正多能性，被美国TIMES评为2009年世界十大医学突破之一。最近的研究证明DNA羟甲基化酶Tet1可以有效替代Oct4将体细胞重编程为iPS细胞并进一步阐释了其分子机制，而所形成的T-iPS细胞可以经四倍体补偿产生iPS小鼠并且没有肿瘤的发生。已经在包括Science, Nature Genetics, Cell Stem Cell, PNAS, Human Molecular Genetics, Stem Cells等国际知名学术期刊发表论文60余篇。

原文摘要：

Maternal SALL4 Is Indispensable for Epigenetic Maturation of Mouse Oocytes

Splat-like 4 (Sall4) plays important roles in maintaining pluripotency of embryonic stem cells and in various developmental processes. Here, we find that Sall4 is highly expressed in oocytes and early embryos. To investigate the roles of SALL4 in oogenesis, we generated Sall4 maternal specific knockout mice by using CRISPR/Cas9 system. And we find that the maternal deletion of Sall4 causes developmental arrest of oocytes at germinal vesicle stage with non-surrounded nucleus and the subsequent……

参考文献：Cooperative Action between SALL4A and TET Proteins in Stepwise Oxidation of 5-Methylcytosine