游离DNA的发现让肿瘤检测大不同

自从在血液中循环的DNA被发现以来，那些来自恶性肿瘤的游离DNA（cell-free DNA，简称cfDNA）就引起了科学家的极大兴趣。近年来，围绕游离DNA的一些挑战正逐渐被攻破，而这些研究成果也正逐步转化为临床应用。GEN网站近日介绍了这些进展。

哈佛大学医学院的助理教授Geoffrey R. Oxnard表示：“游离DNA稳定，容易采集，也容易分析，但我们还在研究它包含什么。”Oxnard博士及其同事开发出一种策略，以区分非小细胞肺癌患者的EGFR T790M突变是来自生殖细胞，还是来自肿瘤。

cfDNA是一种复杂的混合物，包含良性细胞、白细胞和病毒的核酸，而肿瘤DNA似乎只占了一小部分。Oxnard博士的研究结果发现，绝大多数游离DNA是来自生殖细胞。“我们得到的启示是，我们还不清楚液体活检究竟是检什么，目前还需要大量的工作，才能开发出真正影响治愈率的检测。”

对cfDNA分子变化的研究，离不开各种生物学技术。Oxnard博士认为：“对于明确的问题，比如寻找EGFR耐药突变，数字PCR是一种经济有效且可扩展的方法，让我们能够研究许多标本。”其他的探索性问题则需要广泛的平台，如新一代测序（NGS）。

TEC-seq测序技术

约翰霍普金斯医学院的研究人员开发出一种不同的方法，对cfDNA进行早期检测。据肿瘤学教授Victor E. Velculescu介绍，这是一种广泛适用的方法，对许多类型的癌症都有效。今年8月，这项成果发表在《科学转化医学》杂志上。

研究人员对200名结直肠癌、乳腺癌、肺癌或卵巢癌的患者以及44名健康个体开展液体活检。他们利用一种称为靶向错误校正测序（TEC-Seq）的超深度测序方法，来评估循环游离DNA中的58个癌症相关基因。
对于138名早期癌症患者，研究人员在59%到71%的血浆样本中发现了体细胞突变，而具体比例随癌症类型的不同而不同。在大约16%的健康个体中，研究人员发现了与年龄相关的微小变化，但对照组没有明显的癌症相关改变。

检测循环肿瘤DNA中的突变，挑战在于突变很罕见，且DNA又被稀释，这使得常规测序方法获得的信息量很少。于是，Velculescu领导的团队开发出TEC-seq方法，它从血浆中纯化游离DNA，并制备出文库，用于超深度的测序。“多个分子的多次测序可鉴定出真正的改变，”他说。同时，他们采用的算法可区分多个来源的DNA，包括肿瘤、生殖细胞和血细胞。

在cfDNA的分析中，大量工作集中在从各种定性和定量信息中提取临床和预后信息。“循环肿瘤DNA的存在对诊断非常重要，也有望告知疾病的严重程度，”Velculescu博士说。例如，游离的循环肿瘤DNA可能来源于原发性肿瘤，也可能来自未被发现的转移病灶。

研究人员追踪了31例结直肠癌患者在切除肿瘤后的治疗反应和疾病进展。他们表示，手术前循环肿瘤DNA的水平较高往往与总体生存率较差一致。“我们需要对各种类型的癌症患者开展更大规模的试验，以证明它的敏感性和特异性与我们观察到的一致，并且适用于临床环境，”他们称。

数字PCR检测

数字PCR也是此领域研究人员青睐的技术。据Bio-Rad数字生物学中心的主任George Karlin-Neumann介绍，数字PCR检测具有高的特异性和敏感性，可检测一些难以区分的突变，如单核苷酸多态性。

在Bio-Rad的微滴式数字PCR中，微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。这样，每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。反应在96孔PCR板上进行，之后用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算目标分子的浓度或拷贝数。

与实时定量PCR不同，ddPCR不需要标准品，可计算出目标分子的绝对浓度。这样，研究人员可获得更精确的测量结果。在实时定量PCR中，抑制剂或未知成分的存在有可能影响PCR的效率，但数字PCR不需要担心这样的问题。“它可以更好地耐受扩增效率达不到100%的检测，”Karlin-Neumann博士说。

ddPCR平台一般在3-4小时内提供第一批结果，而整块96孔板可在5小时内读取。它特别适合已知标记物的检测，或者突变数量相对较少的癌症。与其他复杂的技术相比，ddPCR显得更加经济实惠。

Karlin-Neumann博士强调：“目前，液体活检面临的挑战是确定临床实用性。”过去，人们通常利用CT扫描或其他成像技术来评估患者对治疗的反应，或者是对血液中那些不太完美的蛋白标志物进行检测。

正如一些癌症类型所示，监控血液中的肿瘤DNA似乎能提供肿瘤大小的信息。现在的问题是，从肿瘤DNA中获得的信息是否能改善临床结果。“我们希望是这样，并且有理由相信临床实用性将体现在治疗和报销上，”Karlin-Neumann博士谈道。

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