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如何研究lncRNA?三位科学家现身说法

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年11月23日 来源:生物通

摘要:

  这些类似mRNA的转录本在各种基因调控水平和胚胎发育等生物学过程中发挥作用。越来越多的证据也表明,异常表达的lncRNA在多种疾病状态中发挥重要作用,如癌症。这些RNA尽管在十几年前就已经发现,但只有少数分子的功能得到鉴定。

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人生如戏,相信长链非编码RNA(lncRNA)也体会到了。之前一直遭冷遇,如今却是万人迷。其实,人类及其他哺乳动物的基因组转录了数万条lncRNA。根据GenCode数据库中最新版本的数据,人类基因组中包含16,000条lncRNA,产生了近28,000条转录本。再加上其他数据库的数据,目前已知的lncRNA超过40,000条。

这些类似mRNA的转录本在各种基因调控水平和胚胎发育等生物学过程中发挥作用。越来越多的证据也表明,异常表达的lncRNA在多种疾病状态中发挥重要作用,如癌症。这些RNA尽管在十几年前就已经发现,但只有少数分子的功能得到鉴定。

德克萨斯大学西南医学中心的药理学教授David Corey表示:“你必须从检测非编码转录本开始。”他的研究方向是将lncRNA作为药物靶点。“我对这些数据库不感冒,因为可能存在错误。他们可能检测到你的细胞系中不存在的RNA或很少量的RNA。”

若并非全基因组范围内的检测,Corey博士通常利用定量PCR来检测非编码转录本。“如果我们认为那儿有一条非编码转录本,我们就用5’和3’ RACE来扩增和检测这些区域,”他说。“了解它的起始位点和终止位点是件好事,但不一定是必需的。如果你主要对功能感兴趣,那么就不用了解全部情况,若存在重叠的转录本,检测起来也比较困难。”

如果转录本的确存在,下一步则是利用逆转录来生成RNA,“或者购买一条适当长度的RNA,但是序列必须相同,”Corey博士说。“你必须使用完全相同的qPCR引物,否则失之毫厘,谬以千里。”

当然,与mRNA相比,分析这些lncRNA面临独特的挑战。据ArrayStar的资深科学家Yanggu Shi介绍,lncRNA的丰度水平通常比mRNA低十倍,而且组织特异性高,近80%的lncRNA是组织特异的,但mRNA不到20%。lncRNA的注释比较少,因为它们不编码蛋白质。此外,一些lncRNA没有poly(A)尾。它们大多位于细胞核中。“基于这些原因,我们需要一些特殊方法来分析和注释,”Shi博士说。ArrayStar专门开发分析RNA表达和调控的工具,特别是调控性的非编码RNA。

举个例子,RNA测序通常产生4000万条序列,但lncRNA的测序覆盖度太低,不足以进行可靠定量。“利用这种方法,lncRNA测序至少需要1亿条序列,比常规的mRNA测序要多得多,”Shi博士解释道。“相比之下,芯片受低丰度转录本的影响没那么大,且错误定量的几率较低。”

据Shi博士介绍,ArrayStar的lncRNA芯片带有许多注释,得到实验支持,并被许多文献引用。比如,ArrayStar芯片曾出现在《Nature Cell Biology》的一篇论文中,说明三阴乳腺癌中的细胞质LINK-A lncRNA激活了常氧下的HIF1α信号通路1。

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最近,lncRNA序列的系统分析也取得了很大进展。Broad研究院(现科罗拉多大学)的John Rinn博士系统分析了影响核定位的lncRNA序列。他们开发出一种大规模并行报告检测(MPRA),可鉴定出38种人类lncRNA中与核富集相关的序列。这项成果于2017年9月发表在预印本网站bioRxiv上2。

“大规模并行报告检测对DNA很有用,”Rinn博士说。“它们挖掘出一切看似活跃的东西,并确定哪些是真正活跃的。我们也需要类似的技术来研究RNA的核富集。因此,我们将100,000条寡核苷酸混合在一起,看看哪些能将细胞质的报告基团带回细胞核。只要你选择活跃或非活跃,我们就能将它们分开。”

利用这种方法,Rinn博士及其团队鉴定出109个独特且保守的核富集区,它们来自29个不同的lncRNA。他们还在核富集区中发现了两个较短的motif,并利用单分子RNA荧光原位杂交(smRNA-FISH)进一步验证了几个区域是否足以影响核定位。

“对于RNA而言,这一切都归结为结构,”Rinn博士说。“以研究最为透彻的RNA为例,端粒酶RNA(TERC)。它是生存所必需的。酵母和人类的端粒酶的大小和序列不同,但它们可以交换,仍然起作用。进化并没有保留这个基因的序列,但保留了它的结构和结合伴侣。通过这种分析,我们可以改变序列,但保留结构,看看它们是否仍然能结合。”

Corey博士则在继续寻找可能成为治疗靶点的lncRNA。“目前,我们特别感兴趣的是一个内含子中的重复扩增,它与Friedrich共济失调相关联,”他说。“如果我们能够上调这个靶点,则有望治疗这种疾病。”

(作者:Gina Shaw / 生物通编译)

参考文献:

1. The LINK-A lncRNA Activates Normoxic HIF1α Signaling in Triple-negative Breast Cancer [Nat Cell Biol. 2016]

2. High-throughput identification of RNA nuclear enrichment sequences [bioRxiv. 2017]

(http://www.ebiotrade.com/)
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