11月王牌聚焦：CRISPR技术新趋势与超越CRISPR的新技术

　　

生物通报道：如日中天的CRISPR技术不断在发展，本月有了更进一步的研究进展，同时也有越来越多的值得关注的新技术出现：

同期Nature，Science发布CRISPR重大技术突破：精确修复基因组

两个研究小组宣布了CRISPR技术的重大突破：他们研发出了能精确靶向RNA和DNA的新CRISPR技术，这种方法与原始的CRISPR基因编辑系统不同，后者是一种虽然可以剪切大部分DNA，但相对来说不可预测，且不是十分锋利的“分子剪刀”，而新技术系统则能重写单个碱基，这一改变单一碱基的能力意味着研究人员现在可以一半以上的人类遗传疾病了。

生物学课本告诉我们，核酸中的含氮碱称碱基，包括嘌呤和嘧啶两类。嘌呤主要有腺嘌呤（adenine，A）和鸟嘌呤（guanine，G）；嘧啶主要有胞嘧啶（cytosine，C）、尿嘧啶（uracil，U）和胸腺嘧啶（thymine，T）。在DNA中，碱基A和T配对，C和G配对，就像字母一样，编写了人类的遗传信息。在人类的疾病中 ，由鸟嘌呤（G）向腺嘌呤（A）的突变极为常见 。类似的突变能在罹患局灶性癫痫（focal epilepsy） 、杜氏肌营养不良 、或是帕金森病的患者体内找到 。因此如果能逆转这一常见突变 ，把A矫正回G，就有望从根源上治疗这些疾病 。

到目前为止，CRISPR-Cas9基因组编辑方法一直依赖于称作为同源介导修复(Homology-directed repair, HDR)的细胞机制，DNA双链断裂可以触发HDR。研究人员提供给细胞一个包含所需序列的模板，用Cas9酶造成靶向双链断裂，随后等待看HDR是否能够整合进这一模板重新连接DNA链。不幸地是，这种方法低效，且往往会以随机核苷酸插入或缺失形式在断裂点周围导入一些新的错误，使得它无法适用于治疗纠正点突变。

最新发表于Nature上的研究（Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage）实现了上述的反方向，也就是将腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）转化为胞嘧啶（C）或鸟嘌呤（G），这样就可以消除最常见的“点突变”类型。

研究证实，在人胚胎肾细胞和骨癌细胞中，这种技术能以约50％的效率进行校正，而且几乎没有可检测到的副产物。相比之下，更传统的基于CRISPR的方法，只能达到小于5％的效率，并且经常会导致未预料的大块DNA插入或缺失。

首尔国立大学分子遗传学家Jin-Soo Kim点评道：“这是基因组编辑领域的重大突破。”

Cas13a：一种与众不同的CRISPR核酸酶

CRISPR是一种出色的基因组编辑工具，深受研究人员的欢迎。其中，大家比较熟悉的是来自化脓链球菌的Cas9（SpCas9）。不过，这并不是唯一的选择。一种新型核酸酶Cas13a（以前称为C2c2）正逐渐走进人们的视野，它具有独特的性质，进一步扩展了CRISPR工具箱。

Cas13a最初是由Broad研究所的研究人员发现的。2015年，Shmakov及其同事利用Cas1作为“诱饵”，来鉴定细菌基因组中与CRISPR相关联的蛋白。通过此次分析，他们鉴定出53个候选基因，总共分成三大类：C2c1、C2c2和C2c3。C2c1和C2c3与Cpf1有些类似，不过它们需要tracrRNA和crRNA才能切割DNA目标，而Cpf1仅需要crRNA。

再来看C2c2（也就是Cas13a）与Cas9的区别。最大的区别在于Cas13a结合并切割RNA，而Cas9切割DNA。从结构上来看，Cas13a含有两个HEPN结构域，而Cas9用HNH和RuvC结构域来切割DNA目标。HEPN结构域对Cas13a切割RNA目标是必需的。另外，与Cas9类似，Cas13a分子中关键残基的突变可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a（dCas13a），它能够结合RNA目标但无法切割。

那么，Cas13a可以应用在哪些方面呢？对于初学者来说，Cas13a可用来结合和切割RNA目标，不过这方面的应用可能受限，因为一旦目标被破坏，Cas13a就会失去控制。因此，Cas13a的突变体研究有望成为新的热点，使其特异切割RNA目标，但是随后不会切割非特异的RNA。此外，人们可利用dCas13a来分离群体中的特定RNA序列，或利用荧光标记的dCas13a来研究活细胞中的RNA加工。

最近，张锋实验室还发表了一篇文章，证明了Cas13a可以高特异性地检测RNA单分子。他们开发出的SHERLOCK系统可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒，并确定病毒载量，区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型，并鉴定游离DNA中的肿瘤突变。未来，Cas13a有望继续扩大CRISPR的应用范围。

超越CRISPR的新技术，直接靶向细胞蛋白

人体中，蛋白质执行着几乎所有我们需要的生物进程，如果蛋白质功能出现问题就会导致许多疾病。为了研究蛋白质的功能，研究人员需要将其从细胞中剔除，然后分析这样导致的后果。目前比较常用的方法是CRISPR-Cas基因组编辑和RNA干扰技术，这两种分别针对于DNA和RNA的水平。但是这些方法对蛋白质的影响是间接的，需要时间的。

近期来自德国和英国的科学家们提出了一种叫做 Trim-Away 的新方法， Trim-Away可以直接快速剔除任何细胞类型中的蛋白质。这种方法的一大优势在于可以区分蛋白质的不同变体，因此也为疾病的治疗打开了一扇新的门。

这一研究成果公布在11月16日的Cell杂志上。文章的通讯作者，德国马普生物物理化学研究所Melina Schuh表示，“利用Trim-Away，我们第一次可以在任何类型细胞中直接靶向任何蛋白。这种方法非常简单，可以在几分钟内剔除蛋白质，而且比基因组编辑或RNAi技术要快得多，这两种方法通常需要几个小时甚至几天的时间才能剔除蛋白，这给了细胞时间去发展用于补偿的机制，有时就会掩盖实际效应。此外，基因组编辑和RNAi并不适用于研究长时间存在的蛋白，和原代细胞中的蛋白，现在利用Trim-Away，我们就可以填补这个空白了。

（生物通）