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如何利用CRISPR-dCas9来研究基因调控

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年12月22日 来源:生物通

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  顺式调控元件(TRE)和反式调控元件(CRE)一直是人们感兴趣的对象,通常利用染色质免疫沉淀(ChIP)和染色质捕获技术来研究。不过,德克萨斯大学西南医学中心的研究人员最近开发出一种新方法,结合CRISPR的靶定能力以及生物素-链霉亲和素的互作优势来鉴定TRE和CRE。

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顺式调控元件(TRE)和反式调控元件(CRE)一直是人们感兴趣的对象,通常利用染色质免疫沉淀(ChIP)和染色质捕获技术来研究。不过,德克萨斯大学西南医学中心的研究人员最近开发出一种新方法,结合CRISPR的靶定能力以及生物素-链霉亲和素的互作优势来鉴定TRE和CRE。

这种名为CAPTURE的方法利用生物素标记的dCas9来分离与天然的染色质背景相互作用的调控元件(CRE和TRE)。CAPTURE包括三个关键的组分:1) 带有生物素接受位点的dCas9;2) 生物素连接酶BirA,它将生物素添加到接受位点;3) 将生物素化的dCas9引到目的位点的gRNA。靶定之后,通过甲醛交联来固定蛋白与DNA相互作用。之后就是个性化的实验方案了。

捕获TRE

如果目标是TRE,则将染色质打断成小片段,通过生物素-链霉亲和素免疫沉淀将与dCas9关联的片段拉出,并通过质谱开展分析。这个版本称为CAPTURE-Proteomics。它可回答的问题与ChIP有点类似,但不是用TRE作为诱饵,而是用DNA作为诱饵来分离相关的TRE。CAPTURE不需要预先知道哪些TRE参与基因调控,也不需要ChIP级别的抗体。

就技术而言,CAPTURE与另一种ChIP方法非常相似,前者是利用生物素标签来纯化,而后者是利用Protein A标记的dCas9以及抗体纯化。相比之下,生物素-链霉亲和素之间的亲和力要比抗原-抗体的互作要高得多,这不仅增加了检测的灵敏度,也提高了特异性。

捕获CRE

如果目标是CRE,则用DpnII限制性酶消化DNA,并将末端连接在一起形成DNA环。这个过程可以连接看似遥远但实际靠近的DNA片段(如启动子和增强子的相互作用)。然后,将这些DNA环打断成较小的片段,同样利用生物素-链霉亲和素互作将与dCas9相连的片段拉出,接着开展双端测序。这种方法被称为CAPTURE-3C-Seq。它与其他染色质捕获方法(3C、4C、5C、Hi-C)类似,但不需要PCR扩增,且分辨率更高。

CAPTURE-3C-Seq的另一个好处在于它可以实现多重检测,一次表达多个gRNA。这是因为在样本处理过程中,感兴趣的DNA序列与CRE有着物理连接。不过,值得一提的是,CAPTURE-Proteomics不适用于多重检测,因为TRE和DNA之间的连接丢失。

为了展示CAPTURE的应用,研究人员主要研究了β珠蛋白基因座。这个基因座之前被充分研究过,带有许多TRE和CRE。此外,他们还研究了疾病相关突变以及发育如何影响TRE或CRE的位置。总之,这种全面和无偏向的分析有助于人们了解发育和疾病过程中的基因组结构和功能。(生物通 薄荷)

参考文献

1. Xin Liu, Yuannyu Zhang, Yong Chen, et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 2017;170(5): 1028–1043.

(http://www.ebiotrade.com/)
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