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单细胞RNA测序的样本制备指南[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年12月27日 来源:生物通

摘要:

  在开展单细胞RNA测序之前,我们首先要妥善地制备单细胞样本。这虽然有点困难,但本文介绍了一些诀窍和建议,也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x Genomics的Chromium™ Single Cell 3’ Solution,不过也同样适用于其他方案。

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单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种强大的工具,让研究人员能够揭开复杂的生物学系统,分析各个细胞的基因表达动态,从而深入了解疾病发展过程中的细胞进程。在此之前,分析混合细胞群体的基因表达一直是一项困难的任务。

当然,在开展单细胞RNA测序之前,我们首先要妥善地制备单细胞样本。这虽然有点困难,但本文介绍了一些诀窍和建议,也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x Genomics的Chromium™ Single Cell 3’ Solution,不过也同样适用于其他方案。

了解您的样本

样本制备的具体方案因样本类型而异,但无论采用哪种方案,您都必须要确保上样的细胞是有活力的,并且完全解离成单细胞。无论是细胞系还是组织,优化细胞解离的操作都是必不可少的,这样才能避免细胞死亡和裂解。死细胞会裂解,释放出RNA。这种游离RNA会增加背景噪音,影响单细胞数据的质量。

目前有不少现成的样本制备方案,但也许需要针对您的样本类型来修改。比如,悬浮细胞系、磁珠富集的细胞和流式分选的细胞已经呈悬浮状态,只需要洗涤和计数即可。不过,如果样本换成了组织,那就有必要精心优化解离操作,以确保数据质量最高。

另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在RNA含量上相距甚远,而准确测定此参数将影响一些关键决定,比如文库制备过程中的PCR循环数。举个例子,人外周血单核细胞(PBMC)的RNA含量极低,只有0.75 pg/细胞,而HCC38细胞系则富含RNA,含量达到21.6 pg/细胞。

处理也要小心

移液

相信大家都对自己的移液技术充满信心,不过,在处理解离的组织或悬浮的细胞时,还是要格外小心。比如,当细胞静置在管中时,它们开始沉降,因此每次从管的上部或下部吸取时,有可能吸到不同数量的细胞。正确的做法是每次移液之前先混合细胞悬液,然后从管的中部吸取。

同时,细胞必须被温柔对待。大家可能不知道,即使用宽口径的移液吸头,移液混合也会对样本质量产生负面影响。下图比较了在HEK293T细胞上开展的四种不同的细胞混合实验对单细胞数据的影响。剧烈的移液混合和涡旋振荡都会导致细胞过早溶解,释放出RNA,形成背景噪音,最终降低细胞的reads比例。正确的做法是使用宽口径的吸头来轻柔混合细胞悬液。

洗涤

在处理悬浮细胞、解离组织或大量细胞时,强烈建议彻底洗涤。这可以根据样本类型以及scRNA-seq方法来调整。建议的洗涤方案是用含有0.04% BSA的PBS来沉淀和重悬细胞两次,然后用最终体积的PBS和0.04% BSA来重悬细胞。

过滤

大的细胞团块或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风险。为了避免这种状况,建议在上样之前使用细胞滤网(cell strainer),孔径大约为30-40 μm。不过需要注意的是,每次过滤都会造成细胞悬液体积的损失以及细胞浓度的改变。因此,如果需要过滤,在过滤之后应该对细胞重新计数。

细胞计数和活力评估

在洗涤和过滤之后,我们有必要测定细胞活力,以便评估样本质量。尽管方法很多,但简单的台盼蓝染色方法就不错,能够鉴定出活细胞和死细胞的比例。此外,我们还需要开展细胞计数,准确了解样本中有多少个细胞。血细胞计数器当然可以用,不过还有更方便的计数工具,如赛默飞的Countess II FL全自动细胞计数仪。

影响细胞计数准确性的一个重要因素是细胞储液的浓度。研究发现,细胞储液的浓度在700-1200个细胞/µl的范围内是最理想的。超出这个最佳范围,可能导致细胞计数的结果不可靠。如果样本不在这个范围内,建议相应地调整细胞储液的浓度。

去除死细胞

样本中高比例的死细胞可能会影响目标细胞的回收率。死细胞及其他污染物的去除对获得高质量的数据至关重要。当然,样品中的死细胞比例可能差异明显,这要取决于样本类型和制备方法。对于死细胞比例较高的样本,您可以参考10x Genomics的技术指南(Removal of Dead Cells from Single Cell Suspensions Improves Performance for 10x Genomics® Single Cell Applications)。

样本保存

为了尽量避免转录组的变化,在洗涤和计数之后,单细胞的悬液应保存在冰上,等待后续的文库构建。在理想情况下,一旦样本制备好,应尽量在30分钟内使用。

不过,样本在冰上具体能放多久,这也关乎到细胞类型。有些细胞(如PBMC)如果长时间放在冰上,就会形成团块。这些团块很难解离,增加了堵塞芯片的风险,而且每个团队都被当成一个细胞,又降低了计数的精确性。在这种情况下,我们应当尽量缩短放置的时间。

结语

在制备单细胞悬液时,提前规划和精心准备是必不可少的,因为全面考虑各种因素,才有望获得高质量的数据。10x Genomics等公司提供了单细胞样本制备的许多指导,也提供了特定细胞类型的示范方案。如果您的研究对象难以分离到完整细胞,则可以选择新近开发的细胞核分离方案。(生物通 薄荷)

(http://www.ebiotrade.com/)
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