液体活检：带你窥探肿瘤的更多秘密

大家印象中的活检一般是组织活检，也就是通过手术取出组织样本进行分析。无疑，这个过程有风险，又痛苦。是否有替代方案呢？现在真的有啦。新兴的液体活检技术（liquid biopsy）分析血液、尿液、唾液或脑脊液，因此无创或微创，速度快，效率高。

这种革命性的技术有望明显改善疾病诊断、监控和生存期预测。目前，它们主要用于癌症的检测，不过随着技术的进步，科学家相信液体活检有望检测更多的疾病，包括糖尿病、囊性纤维化和牙周炎等。

根据Kalorama Information最近出具的报告，2016年全球液体活检市场的规模大约为3.94亿美元。Kalorama预计，2021年这个市场的规模将达到13亿美元，而2027年更是有望达到33亿美元。

液体活检的对象是生物体液中的各种组分，包括游离的循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、外泌体（exosomes）、蛋白质和RNA等。

循环肿瘤DNA

ctDNA是片段化的DNA，由癌细胞在凋亡或坏死过程中释放到血浆。ctDNA片段极其稀少，这使其分离和鉴定都变得十分困难。由于总的游离DNA（cfDNA）样本中存在少量ctDNA，因此建议使用高度灵敏的技术来检测，比如PCR和新一代测序（NGS）。目前，ctDNA已经用于肺癌患者的临床管理和晚期黑色素瘤的疾病状态监控。

今年5月，Cancer Genetics公司基于赛默飞世尔的Oncomine™ Lung cfDNA assay，推出了Liquid::Lung-cfDNA™，可检测肺癌来源的cfDNA。此产品能够分析与非小细胞肺癌相关的11个基因中的单核苷酸变异（SNV）和小的插入缺失（indel）。

该公司的CEO Panna Sharma认为：“使用NGS或数字PCR的液体活检技术比传统的组织活检更有优势。我们认为，一旦建立了基本的诊断和治疗方案，液体活检能降低检测相关的成本和负担，提供一个更全面的纵向生物标志物图谱，并提高早期检测的敏感性。”

加州大学圣地亚哥分校的一个团队也从事ctDNA研究，希望能够找出一些生物标志物，预测患者对免疫检查点抑制剂的反应。利用69名患者的血液样本，研究人员通过NGS分析了ctDNA。具体而言，他们统计了临床意义未知的变异（VUS）数量。研究发现，29%的患者存在三个以上的VUS改变。

经过免疫检查点抑制剂治疗后，VUS达三个以上的患者响应率（45%）明显高于VUS三个或以下的患者（15%）。“我们的研究表明，ctDNA变异的数量与检查点抑制剂疗法的响应相关联，”个性化癌症治疗中心的主任Razelle Kurzrock说。

循环肿瘤细胞

CTC是从原发性或继发性肿瘤上脱落并进入血液循环的完整肿瘤细胞。CTC的存在，意味着患者患有转移性疾病。对于大多数癌症患者而言，CTC的丰度极低，因此活检通常从富集步骤开始，以便提高CTC的浓度。目前，CTC检测的主要临床应用是提供预后生存预测。

Complete Genomics和加州大学旧金山分校的研究人员最近报告称，他们仅利用5个CTC，就能检测到临床相关的突变。他们的研究对象是一位61岁的女性，患有ER+和HER2-的转移性乳腺癌。

在研究过程中，他们首先分离出34个高纯度的CTC，然后再将CTC中的基因组DNA分到3,072个单独区室中，而每个区室中大约含有5%的癌症基因组。接着，每个区室中的DNA被标上唯一的条形码，之后混合所有DNA，开展全基因组测序。

Complete Genomics负责研发的高级主管Brock Peters博士指出：“通过这34个细胞，我们能够准确检测低至12%的CTC中存在的突变，确定其组织来源，并制定个性化的联合疗法。”

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蛋白质组技术

据Integrated Diagnostics公司的CEO Al Luderer博士介绍，与DNA或RNA等生物分子相比，蛋白质有着更好的信噪比。“蛋白质通常经历了漫长的生物合成，这个过程意味着蛋白质是基于特定的功能原因而存在，往往是长期存在的，几乎没有可检测的合成副产物。”

IndiDx利用蛋白质组学的进展来更好地诊断复杂疾病。它的突破性产品是Xpresys® Lung 2，该产品可以测定血液蛋白质，并鉴定良性的肺结节。“当肺癌出现症状时，通常已经是III期或IV期疾病，”Luderer说。“如果在肺结节很小且没有症状的时候发现它们，那么就有很大的机会治愈。不过肺结节的诊断是个挑战。”

Xpresys Lung 2可以协助医生确定哪些患者采取保守治疗的效果最好。如果检测结果表明结节是良性的，则患者可采用观察等待（watchful waiting）的保守疗法，也就是在两年内进行一系列的低剂量CT扫描。这种对患者肺结节的主动监测可作为一种安全保障，一旦肺结节恶变，则可以尽早进行治疗干预。

RNA标志物

德克萨斯大学奥斯汀分校的研究人员则另辟蹊径。他们正在研究细菌中一种古老的酶，这种酶高度准确地检测到多种RNA标志物。

“DNA标志物是静态的。它们提供了突变的信息，但无法告知这些突变对细胞进程的影响，这在不同个体中是有差异的，”Alan Lambowitz博士观察到。“致癌突变可能有不同的影响，并对治疗作出不同反应，这是个性化医疗的一个重要考虑因素。”

相比之下，“监控细胞内的RNA能够确切地告知病变组织（如癌症）在特定时间到底发生了什么，”Lambowitz说。“这种方法可用来定期监控疾病的发展以及对治疗的反应，并预测身患同一种癌症的不同个体将对不同疗法有何反应。”

Lambowitz预计，液体活检与其他工具相结合，将为专业人士提供所有的信息。他们研究的这一组酶称为TGIRT（热稳定的II组内含子逆转录酶）。TGIRT寻找RNA链，并形成互补的DNA链，这些链在测序后可提供诊断方面的信息。据Lambowitz介绍，由于它们能够从极其少量的RNA中准确生成DNA拷贝，故TGIRT能够在基于RNA的液体活检中更好地发挥作用，捕获疾病的生物标志物。

参考标准

当然，液体活检分析也面临不少挑战。其中，最主要的挑战是利用少量DNA来检测低频率的突变。因此，这些分析必须足够灵敏，才能检测等位基因频率低至0.1-0.01%的突变。

于是，人们专门设计了参考标准，来解决液体活检所带来的挑战。Horizon Discovery的Reference Standards来源于人类细胞系，被打断成平均160 bp的片段。它们覆盖等位基因频率为5%、1%和0.1%的临床相关突变，以便模拟从真正的血浆中提取出的cfDNA。

未来在哪里？

尽管有美好的前景、丰富的研究和巨大的投资，但在眼下甚至不远的将来，液体活检也不能完全取代组织活检。“由于癌症的组织病理学结果才被认为是生物学的真相，而几乎所有的治疗决定都依赖于真正的病变组织，所以组织活检在目前看来是无法取代的，”Luderer说。

Sharma则更加乐观一点。她说：“我们预计在未来三年内，实体瘤的大多数药物监控和疾病检测将转向基于体液或血液的分子方法。”而且，我们越了解肿瘤的分子组成，以及其诊断、预测和预后的价值，我们对传统组织活检的依赖就越少。