PacBio SMRT长读长测序技术结合特殊人类参考基因组完善亚洲精准医学研究

【字体: 时间:2017年02月23日 来源:

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  今天我们就来总结一下这一年来,PacBio长读长测序技术在人类基因组,特别是针对时下*热门的精准医学所取得的重要成果。了解一下SMRT长读长技术在疾病相关研究方面解决了哪些NGS所面临的棘手问题。

  

前言:在刚刚过去的一年里,PacBio SMRT测序技术在人类基因组研究方面取得了非常不错的成绩,中、日、韩三地的科学家们纷纷利用PacBio长读长测序技术打造了属于亚洲人,特别是针对本国的人种特异性参考基因组序列。针对时下大家都非常关注的精准医学,这些特异的参考基因组都有着非常重要的作用。

今天我们就来总结一下这一年来,PacBio长读长测序技术在人类基因组,特别是针对时下*热门的精准医学所取得的重要成果。了解一下SMRT长读长技术在疾病相关研究方面解决了哪些NGS所面临的棘手问题。

大家非常熟悉的人类基因组序列GRCh38,来自于超过50种人种的个体,因此可以说是具有混合的背景。这一基因组为基因的统一注释,序列mapping和基因变异的读取提供了一个国际化的坐标系。尽管GRCh38这样经典的基因组序列在人类基因组学、医学研究上具有非常重要的意义,然而这样的基因组数据并不能充分的反映亚洲人特异的基因组序列。因此针对亚洲人的精准医学研究的中,特异的单体型多样性同样也不能得到很好的解析。

如今下一代测序技术(NGS)在人类遗传多样性研究方面有着广泛的应用,也促进了如今基因组学突飞猛进的发展。但短读长的NGS技术却阻碍了临床上许多重要疾病相关基因的准确分型。这一方面是由于NGS读长短限制导致,NGS能够发现的基因变异的大小非常有限。既不能发现诸如结构变异的基因变异类型,也难以发现新的等位基因。另一方面,现有的由NGS技术获得的所谓参考基因组,并不能完整的呈现等位基因。具有偏差的测序结果不能匹配种族真实的参考基因组序列,往往会导致一些与医学相关基因的不正确定位,又或是基因的错误分型。

为了提高人类遗传学研究的准确性,在过去的一年中,中国、韩国、日本基因组学研究团队相继运用PacBio SMRT测序技术打造了高质量的,具有种族特异性的参考基因组。这样的基因组信息能够更好的代表区域人群中常见的单体型情况。这些新的基因组组装结果使得发现新的等位基因、找到常见或罕见基因变异,包括从单碱基多态性,到大片段的结构变异成为可能。并且能够对人群中单倍型等位基因进行解析和基因分型。这些亚洲人种族特异性的基因组序列,同时也证明了PacBio SMRT测序技术在人类基因组研究以及精准医学研究中的重要价值。


 
种族特异性亚洲人参考基因组

韩国

来自韩国首尔国立大学,千年基因的科学家团队进行了韩国人个体的基因组AK1的测序组装,该成果发表在去年10月Nature杂志上。这一项目主要采用SMRT测序技术,充分的进行了染色体定相分析,并细致分析了与临床相关的重要基因区域的结构变异。(点击回顾“长读长测序技术打造完美Korean基因组”)

标准的短读长测序技术并不能得到如此高的数据质量。研究人员表示,“短读长组装得到的所谓参考基因组,并不能用于研究大片段的结构变异以及二倍体结构定相(phasing),而这些都与精准医学有着非常重要的关系。相反,单分子实时测序(SMRT)技术平台的长读长测序,则能够有效的解决序列中多次重复的结构变异问题。”


 
通过比较AK1组装结果和GRCh37国际参考基因组,发现的韩国人基因组中结构变异(SV)数量

基于长读长测序技术,基因组数据的连续性得到了极大的提升。使得单倍型的深入研究成为可能。该研究团队的科学家们还把目光集中在了单倍体上,对HLA和CYP2D6基因进行细节上的分析。从中发现了CYP2D6基因中的一个等位特异性重复与临床密切相关。针对这一研究成果,科学家们表示“这一结果说明,基于de novo组装的定相分析,在解析难以解读的高度可变区方面具有很大的优势,并且这一方法可以进一步用于药物基因组学。”


 
CYP2D6和CYP2D7等位基因在AK1韩国人参考基因组中的单倍体定相

来自美国纽约西奈山医学院的研究团队 也得到了CYP2D6基因比较相似的成果。他们的研究以长PCR技术富集目标序列,结合PacBio长读长技术,为大量人群的研究中,高度可变区域的分型提供了一个更为经济的方法。此项研究结果发表在Human Mutation杂志上。

中国

来自中国暨南大学、美国南加州大学等机构的研究团队们,采用PacBio SMRT测序技术,对中国人HX1进行了de novo基因组组装及转录组学研究,研究成果发表在了2016年的Nature Communications上。在这一研究的de novo组装中,发现了与中国人特有的12.8Mb新的参考基因序列,在此之前从未报道过。这更进一步证明了特异性人种参考基因组的价值。(点击回顾“ 我国科学家利用PacBio长读长测序技术完成首个中国人全基因组de novo测序”)

对HX1的研究中发现,有一半的结构变异为短串联重复结构,或者是移动元件。短重复结构变异包括简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSR),以及短串联重复(Short Tandem Repeats,STR)。这些短重复结构变异都可能与一些临床疾病相关,包括一些研究得比较透彻的重复序列增加性疾病,例如脆性X染色体综合征,亨廷顿病,共济失调和渐冻症(ALS)等。但由于NGS读长太短,不足以覆盖重复序列异常增加的致病序列区域,以及其他的结构变异;再加上NGS还有极强的GC偏好性,在GC异常区域容易形成不可逾越的gap。如果仅仅用NGS方法来进行我们现在提出的精准医学研究,在结构变异研究的方面将会受到极大的限制。*终Miss掉许多有用的序列信息。

日本

在日本,东北大学设立的东北医疗大学组织(Toumoku Medical Megabank Organization,ToMMo),运用PacBio SMRT测序技术,完成了针对日本人的参考基因组(JRGv1)。测序结果在2016年4月已经发布。科学家们将使用这些序列信息,建立日本人群中结构变异的分类目录,以支持今后的基因组项目,并且促进本国基因组科学的研究发展。科学家们通过采用PacBio长读长测序的优势来解析结构变异。通过与GRCh38比较,鉴定到了大约3500个新的插入序列,大小约为2.5Mb。

 

国际参考基因组GRCh38与日本人参考基因组JRGv1的比较

新的参考基因组将有力的促进精准医学的发展。依赖短读长技术的GRCh38基因组,虽可以用于一些常见的单碱基的变异检测,但无法准确的的进行结构变异分析。而通过与新的日本人特异的参考基因组JRGv1进行比对,则能够更容易的进行结构变异的基因分型。

低覆盖度的长读长全基因组测序

目前,还有一些研究人员通过SMRT测序技术,对人类个体进行了低覆盖度(通常为10倍)的全基因组测序。这一方法不必得到参考基因组水平的de novo基因组组装数据,但揭示了个体基因组中大部分结构变异,完成了等位基因特异性单倍体的定相。

例如我们*近关注过的一篇报道,就是用这一方法,对个体进行低覆盖度的全基因组测序,以检测未诊断的罕见疾病。(点击回顾“PacBio临床应用捷报-首次确认Carney综合征大片段缺失突变”)

这名患者个体为Carney综合征的疑似病例。但运用短读长的NGS测序技术,进行了平均36X深度的测序,并没有检测出任何可以解释患者临床表征的遗传变异。但运用低覆盖度的长读长全基因组测序,以平均8.6X的测序深度,检测到了一个新的病原性的杂合缺失,这一缺失存在于在PRKAR1A基因的第一个编码外显子中,长度大约为2kb。而这一结构变异也通过Sanger测序法进行了验证,并界定为罕见的孟德尔疾病(也称作Carney综合征)的病因。


 
运用低覆盖度长读长全基因组测序,发现病原性结构变异——Carney综合征研究

总结

通过进一步提高单体型的解析程度,以及发现新的结构变异,PacBio长读长测序技术在针对亚洲人群体中,发现新的,特别是与医学有着密切相关的等位基因上有着非常重要的作用。而结构变异的检测在此之前,往往由于NGS技术读长及测序偏好性的限制,并没有得到足够的重视。但随着PacBio技术的发展,我们对结构变异和等位基因多样性的研究也在逐步的加深。无论是种族特异性人类参考基因组的打造,还是疾病相关基因的研究,都将离不开结构变异的发现和检测。

而新兴的SMRT应用,比如靶向捕获、低覆盖度的全基因组测序检测结构变异,不仅降低了研究的成本,还可以增加可处理的样本大小。这一数据将帮助进一步解析临床上重要的,种族特异性的等位基因,以及并不常见的结构变异,从而加速精准医学在亚洲人群中的应用发展。相信随着长读长测序技术的不断进步,精确医学研究将获得越来越多重大的发现。

欢迎索取PacBio SMRT长读长测序技术的详细资料

基因有限公司作为Pacific Biosciences公司中国区独家代理商,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

参考文献
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4.  Shi L, et al. (2016) Long-read sequencing and de novoassembly of a Chinese genome. Nature Communications. 7, 12065.
5.  Tohoku Medical Megabank Project. “Japanese Reference Genome: JRGv1.”Tohoku University and Iwate Medical University, 25 Apr. 2016. Web. 31 Jan. 2017.
6.  Wenger A, et al.“Identifying Structural Variants in NA12878 from Low-Fold Coverage Sequencing on the PacBio Sequel System.”Web blog post. PacBio Blog. PacBio, 19 Oct. 2016.
7.  Merker J, et al. (2016) Long-read whole genome sequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease. bioRxiv. doi:10.1101/090985.

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