Nature子刊：迄今为止最小的Cas9基因剪刀

　　

——IBS科学家发现了迄今为止最小CRISPR-Cas9家族成员，研究表明它可以通过腺相关病毒编辑突变致盲基因。

生物通报道：韩国基础科学研究所（Institute for Basic Science, IBS），韩国首尔大学等处的研究人员设计出了目前最小的CRISPR-Cas9，并通过腺伴随病毒（AAV）将其递送到了肌细胞和小鼠的眼睛里，用以编辑导致失明的基因。

这一研究成果发表在Nature Communications上，这种CRISPR-Cas9系统源自空肠弯曲杆菌（CjCas9），未来也许会成为一种有效治疗一般疾病和“无药可救”的疾病的新工具。

CRISPR-Cas9红得发紫，作为“基因剪刀”蛋白，Cas9需要在导向RNA指引下在精确靶基因位置进行切割。CRISPR-Cas9复合物要想到达靶标DNA，就需要通过质粒或病毒递送。IBS基因组工程中心主任KIM Jin Soo解释说：“AAV是一种在体内表达目标基因的有效和安全的载体，已广泛用于基因治疗。”

天然状态下，Cas9是细菌的免疫武器，切割可能损害细菌的病毒DNA。最常见的CRISPR-Cas9技术使用的是源自细菌化脓性链球菌的Cas9。然而这个蛋白由1,368个氨基酸组成，体积太大不能通过AAV包装和递送。即使科学家们将其分成两部分，分别包装在不同的病毒，也会出现其它的问题，如需要两倍的病毒量，活性要比完整的Cas9小。金黄色葡萄球菌Cas9也可以用于基因编辑，且体积稍小（1,053个氨基酸），因此它可以通过AAV传输，但这种Cas9又没有足够的空间可以装载其它蛋白。

在这项最新研究中，研究人员发现CjCas9大小合适，而且高效，这个蛋白有984个氨基酸，可以与多个导向RNAs，还有荧光报告基因一同包装进AAV中。

为了利用细菌蛋白进行基因编辑，研究人员优化了这一技术，他们设计了一个短的DNA序列，接在紧挨着Cas9靶向的DNA序列，即Protospacer Adjacent Motif（PAM）。每个不同的Cas9需要一个特定的PAM序列，否则就无法结合，并切割靶标DNA序列。此外，研究人员还修改了导向RNA的长度。

完成这种优化后，研究人员将新的CRISPR-Cas9复合体，连同两个导向RNA和荧光报告蛋白一起包装到AAV中，朝着小鼠肌肉和眼睛中的突变基因传递。他们主要聚焦于涉及年龄相关性黄斑变性（AMD）的两个基因，这也是成年人失明的主要原因之一。

一个基因是ADM的常见治疗靶标，称为血管内皮生长因子A（VEGF A），另一个基因是激活VEGF A的转录的转录因子：HIF-1a。后者此前并未被当作药物靶标。在这项研究中，研究小组证明CjCas9通过AAV传递到了视网膜，可以有效地使小鼠中的Hif-1a和VEGF A失活，并减少脉络膜新血管形成（CNV）的面积。

KIM Jin-Soo解释说：“CjCas9具有高度特异性，不会出现基因组中的脱靶突变。”

（生物通：万纹）

原文标题：

In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni
Several CRISPR-Cas9 orthologues have been used for genome editing. Here, we present the smallest Cas9 orthologue characterized to date, derived from Campylobacter jejuni (CjCas9), for efficient genome editing in vivo. After determining protospacer-adjacent motif (PAM) sequences and optimizing single-guide RNA (sgRNA) length, we package the CjCas9 gene, its sgRNA sequence, and a marker gene in an all-in-one adeno-associated virus (AAV) vector and produce the resulting virus at a high titer. CjCas9 is highly specific, cleaving only a limited number of sites in the human or mouse genome. CjCas9, delivered via AAV, induces targeted mutations at high frequencies in mouse muscle cells or retinal pigment epithelium (RPE) cells. Furthermore, CjCas9 targeted to the Vegfa or Hif1a gene in RPE cells reduces the size of laser-induced choroidal neovascularization, suggesting that in vivo genome editing with CjCas9 is a new option for the treatment of age-related macular degeneration.