精准诊断——疾病标志物：破解健康悬梁之剑

让精准医学更精准：超高分辨质谱解决方案

　　

2015 年初，奥巴马提出精准医学计划，意在大规模测定癌症病人的全基因组，获得大数据，挖掘癌症驱动基因，实现个性化精准用药，解决癌症对人类的威胁。2016 年初，拜登的癌症登月计划（Cancer Moonshot 2020）使精准医学计划正式落地。精准医学很快红遍全球，在世界各地、在国内也迅速催生出大量的聚焦精准医疗的创业公司。

基因检测是目前癌症精准分型与精准用药的主要方法。但是，基因与生命活动的最终执行者——蛋白质之间仍然存在较大差异，难以直接反映生命变化。中心法则告诉我们，基因水平信息反映的是疾病发生的概率（即可能性），而蛋白质作为生命活动的最终执行者，其状态的改变更为直接地反映了疾病的发生、发展状况。相比于基因来说，蛋白质更适合作为一种动态指标，精准地发现与诊断疾病。因此，精准医学离不开蛋白质组学。

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蛋白质解析速度的飞跃
是的，蛋白质研究受限于技术手段，比核酸困难太多。纯化，扩增，测序，对核酸来说都不是问题，特别是新一代测序技术的突飞猛进，成为助飞当今精准医学热的最大动力。但，这些对于蛋白质来说都是难题。今时今日，蛋白质解析速度是否也有突破，一如当年的基因组研究？有。

2014 年，人类全蛋白质组草图绘制完成，这是继人类基因组计划后的第二个生命科学里程碑。时至今日，1 个小时即可完成酵母全蛋白质组分析、1 天时间即可完成人全蛋白质组的深度覆盖（>50% 基因产物）分析。这些成果均得益于静电场轨道阱Orbitrap 超高分辨质谱技术，基于Orbitrap 的蛋白质组已经能够像基因组一样，作为常规分析手段，大规模应用于临床研究与检测。Orbitrap 解析速度已达每分钟 65 种蛋白。

蛋白质解析速度的飞跃催生了哪些研究热点？
临床肿瘤蛋白质组分析联盟（CPTAC）与癌症基因组图谱集（TCGA，The Cancer Genome Atlas）合作，对已完成TCGA基因组分析的肿瘤活检样本再进行在蛋白质组学层面的分析和表征，期望分别在基因组和蛋白质组层面对肿瘤样本进行大规模分析，获得大数据，挖掘癌症机理，实现真正的精准医学。随之而来了一个新名词 —— 蛋白基因组学(Proteogenomics)。随着第一、第二期肿瘤蛋白质组分析的完成，越来越多的科学家意识到蛋白质组对理解癌症的重要性。联盟宣布进行 TCGA 肿瘤活检样本蛋白基因组的第三期研究，针对第二期的研究成果开展大规模临床试验，验证蛋白质组和修饰组层面的癌症表征对更快速、更精准地制定治疗方案的指导作用。此外，7个国家和地区（澳大利亚、韩国、中国大陆、中国台湾、瑞士、加拿大、德国）联合宣布加入癌症登月计划，合作开展大规模癌症样本的蛋白质组学研究。

2016 年 7 月，美国退伍军人事务部（VA）、国防部（DoD）、国立癌症研究所（NCI）三部门联合宣布建立第一个同时进行基因和蛋白信息表征的医学系统，将基因组和蛋白质组作为常规检测手段，对癌症病人进行个性化蛋白基因组（Proteogenomics）表征，为更快速、更精准地用药提供指导。该计划第一步将进行 8000 个癌症病人的蛋白基因组队列研究（AppliedProteogenomics OrganizaionaL Learning and Outcomes (APOLLO)）。

要让癌症分型更精准，仅有测序是不够的。蛋白基因组学(Proteogenomics)，就是通过基因组学、转录组学和蛋白质组学的整合，在蛋白质水平上和后修饰层面上对癌症分型，发现与验证肿瘤相关基因突变、表达量变化、所调控的下游分子等，为基因组提供了更接近表型的验证和解释，为癌症早期发现、良恶性诊断、分型和个性化用药、疗效监测和预后判断等提供了更精确、更可靠的信息，使精准医学更加精准。

新一轮的研究机遇就在前方，可别错过！
来，一起来了解一下Orbitrap 超高分辨质谱的应用，看看如何先人一步将蛋白基因组学融入您的研究中吧！

精准诊断 ── 疾病标志物：破解健康悬梁之剑
疾病标志物从发现到应用分为三个阶段：发现（小规模样本中发现大量潜在标志物）、到初步验证（中等规模样本验证出较为可靠的标志物）、再到大规模确证（大规模样本确证获得最可靠的标志物）并临床应用。Orbitrap 超高分辨质谱是疾病标志物从发现到应用全流程的有效工具和必由之路（图 2）。

1 发现：通过血液、尿液、活检组织等样本，发现特定疾病状态下，健康人群和疾病患者的蛋白质组的定量变化，筛选与该疾病关联的潜在标志物或标志物集 (Panel)。Orbitrap 能够在 1 天内实现 50% 以上的基因覆盖，配合 10 通道的 TMT 标记定量技术，是深度挖掘与疾病相关联的蛋白质变化、准确发现疾病标志物的利器（图 3）。

实例（图 4）：尿液中发现的能够实现胰腺癌早期精准诊断的标志物集（LYVE1、REG1A、TFF1）。

2 验证与确证

通过大样本检测与分析，排除个体差异和实验差异，筛选出高特异性的标志物，中等规模验证、大规模确证其能够准确区分健康人群和疾病患者。验证和确证的关键在于标准化、统一化的分析流程。基于 Orbitrap 的 DIA 流程使用统一的采集模式、标准化的处理方法，是中等规模验证的最佳方案（图 5）。

实例（图 6）：急诊科小儿急性腹痛病因快速诊断标志物的 DIA 验证。

3 应用

在临床检测中用质谱对确证的目标标志物进行监测与绝对定量，可帮助疾病早期诊断、肿瘤良恶性判断、疗效监测。基于 Orbitrap 的 PRM 流程无需方法优化、灵敏度高、分辨率高，并能同时定性定量，是目标标志物大规模确证和临床应用的好方案。

相比于现在的临床检测金标准——免疫学方法，质谱检测优势更大：

a)一次检测上百个标志物的高通量，适用于标志物(Panel) 的检测，如 11 种标志物组成的肺结节良恶性判断标志物集 XpresysLung™
b)不受体内自抗体的干扰，适用于含自抗体的标志物的检测，如甲状腺癌标志物甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)
c)准确区分蛋白序列与翻译后修饰差异，适用检测由 SNP、亚型、翻译后修饰等造成的蛋白异构体，如遗传性血红蛋白病中不同的血红蛋白变异体(Hemoglobin Variants)

实例（图 8）：SNP 突变造成的血清淀粉样蛋白 A 突变体的精准区分与定量。

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从采血到出报告：3小时

真正用于临床检测，需要一整套简单、快速的分析流程，从样本前处理到获得结果全部搞定。指尖采血+大规模自动化的样品前处理+30 分钟的快速质谱分析+高通量数据处理并最终获得报告，全程只需要 3 个小时，能获得 300 多种蛋白的定量结果，其中包含近 50 种 FDA 批准的疾病标志物，这就是Orbitrap临床蛋白质组检测流程带来的变化！（图 9）。

蛋白标志物临床质谱检测的发展

蛋白质组应用于临床不再是未来，除已经被 FDA 批准作为 IVD 的卵巢癌标志物集 OVA1 外，美国已有大量关于蛋白标志物质谱检测的实验室自建方法 (LDT) 已用于临床检测服务（图 10）。