细胞冻存经验谈:选对冻存培养基才是王道[心得点评]

【字体: 时间:2017年03月21日 来源:生物通

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  研究人员经常需要冷冻细胞并保存,以供后续实验或临床使用。基本过程相当简单:慢慢冷冻细胞,将冻存管放入液氮中,并在需要时快速解冻。冻存培养基能支持细胞并防止冰晶形成。不过,Malfavon的体验告诉我们,使用不同的冻存培养基,结果那可是大不同。

细胞冻存,这是一项艰巨的任务,因为细胞那么娇贵。最近,加州大学圣地亚哥分校的博士后Mario Malfavon也遇上了这个难题。他需要研究大鼠的原代脑细胞,而不是小鼠,他们研究小组之前可还没人做过。在冻存细胞时,他不清楚哪种类型的培养基最适合,一切只能靠猜。

第一次尝试的结果告诉他:惨了,猜错了!只有四分之一的细胞在解冻后存活。之后,Malfavon从Cell Applications公司订购了一些细胞,并获赠了一瓶特殊的冷冻培养基。这瓶东西犹如一棵救命稻草。如今,Malfavon能够解冻足够的细胞,开展他的大规模实验。

研究人员经常需要冷冻细胞并保存,以供后续实验或临床使用。基本过程相当简单:慢慢冷冻细胞,将冻存管放入液氮中,并在需要时快速解冻。冻存培养基能支持细胞并防止冰晶形成。不过,Malfavon的体验告诉我们,使用不同的冻存培养基,结果那可是大不同。

一些经验老道的研究人员自己制备冻存培养基。不过,那些面对脆弱细胞(比如原代和多能细胞)的研究人员,则更喜欢购买标准化的商业产品。一些非常敏感的细胞系也许能从添加物中受益,以避免细胞在解冻时凋亡。

康宁生命科学公司的培训部经理Mark Rothenberg表示:“我始终建议人们试试各种不同的培养基,来看看哪种最适合他们的特定细胞系。每个细胞系都是独一无二的,它们有自己的要求,也有自己的敏感性。”

家酿的配方

永生化的细胞系往往相当健壮,因此,使用实验室自制的冻存培养基,效果也不错。典型的配方是在生长培养基中加入5%到10%的DMSO和5%到40%的血清,或只是在血清中加入10%的DMSO。

DMSO的作用是取代细胞中的一些水,以防止冰晶形成,刺穿细胞。据赛默飞世尔科技的资深科学家Rhonda Newman介绍,DMSO还能防止细胞在冷冻期间发生收缩,而后在解冻时又变得肿胀。

血清,这种富含营养成分的物质,直接支持细胞。“当细胞处于这种营养丰富的环境时,它们能够更好地复苏,”Cell Applications公司的副总裁Daniel Schroen解释道。其中,白蛋白是一种关键的组分,可在细胞周围形成保护性的涂层。当细胞开始解冻时,血清也可以与释放的毒素相结合。

外面的选择

当然,血清也有缺点,那就是批间差。这可能会改变解冻后细胞的复苏效果。这也是许多研究人员喜欢购买冻存培养基的主要原因。这些培养基中通常含有血清替代物,比如一定浓度的白蛋白。Newman表示:“当你面对的是重要细胞时,使用商业化的解决方案也许是最有利的。”

原代细胞往往敏感又脆弱,而对于多能干细胞(PSC),血清组分可能导致它们分化,而且不是朝着你期望的方向。赛默飞世尔的多能干细胞冻存试剂盒就提供了一种化学成分明确的培养基,它只含有人源成分,而不含动物成分。据Newman介绍,不使用牛的血清意味着更好的重复性,并且这种培养基也适用于其他细胞,如神经干细胞。

尽管化学成分明确的商业化培养基不如自己配制冻存液那么经济,但Irvine Scientific公司的产品经理Duncan Liew认为,从长期来看,它也能为干细胞研究人员节省经费。这家公司FreezIS培养基的售价为每10毫升35美元,的确不便宜,但如果更多细胞在冻存过程中存活,那它就是物有所值。

由于每种类型的细胞都有自己的口味,Cell Applications也推出了不同的冻存培养基,分别适用于血细胞、多能细胞和神经元。这家公司将在今年晚些时候推出心肌细胞的冻存培养基,这种细胞可是出了名的难搞。

我想详细了解赛默飞世尔的多能干细胞冻存试剂盒

更多小贴士

尽管DMSO作用重大,但是它有毒!因此,人们也在寻找它的替代物,如甘油和各大公司开发的专利配方。Irvine Scientific就开发了一种不含DMSO的FreezIS。不过,Newman认为,到目前为止,还没有一种冷冻保护剂能真正取代DMSO。

这就使得人们需要尽快从解冻的细胞中去除DMSO。一些研究人员将解冻的细胞离心,并重悬在不含DMSO的生长培养基中;另一些人则喜欢将细胞铺板,在细胞稳定之后更换培养基。前面24小时是至关重要的。当细胞复苏时,自由基积累,因此许多解冻时存活的细胞仍有可能死亡。Liew表示,人胚胎干细胞或诱导多能干细胞在这个时候就特别脆弱。

对于敏感的细胞系,在解冻后第一天使用培养基添加剂也许能帮它们渡过难关,比如ROCK抑制剂(Y-27632)能阻断导致细胞凋亡的Rho激酶通路。赛默飞世尔的PSC试剂盒就带有RevitaCell添加剂,它含有特异性更高的ROCK抑制剂以及抗氧化剂和自由基清除剂。

对于冻存培养基而言,最关键的一点是适合你的细胞,并没有所谓“一招鲜吃遍天”的产品。即使是大家都在用的爆款产品,也不一定适合你哈。

(作者:Amber Dance / 生物通编译)

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