如何利用CRISPR编辑iPS细胞

　　

生物通报道：CRISPR基因编辑和iPS重编程是生命科学领域近十年最热门的两大技术。现在，科学家们正在撮合它们联姻。

干细胞能够分化成为机体内任何类型的细胞，既是研究人体早期发育的理想工具，也是细胞治疗的宝贵资源。胚胎干细胞很适合临床使用，但获得这些细胞会破坏胚胎，有很大的伦理争议。2006年日本科学家山中伸弥开发了一个变通方案，用逆转录病毒将四个转录因子（OSKM）引入特化的成体细胞，再将其重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。这些细胞在实验室中表现出与胚胎干细胞相当的能力，又避开了胚胎干细胞的伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，被人们视为细胞疗法的新希望。山中伸弥也因为iPS技术赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。

CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复，细菌通过CRISPR与内切酶Cas组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能根据向导RNA的指引切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统可以简单精确地编辑任何基因组区域，据说新手可在一周内学会用CRISPR编辑传统的永生细胞系（比如HeLa或HEK293）。此外，研究者们还在CRISPR的基础上开发了调控基因表达的新工具。

人们普遍认为，iPS与CRISPR的结合会起到一加一大于二的效果。举例来说，CRISPR用于人类iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。虽然CRISPR-Cas9和人类iPSC在实验室中已经相当普及了，但二者相结合并没有想象中那么容易。The Scientist杂志与多位正在使用这两个工具的专家联系，推出了在人类干细胞中使用CRISPR的基础指南。这份指南对人iPSC和人胚胎干细胞同样适用。

基本工作流程

在人iPSC中用CRISPR编辑基因或者控制基因表达，你需要开启两条平行的任务线：1）培养充足且可靠的多能干细胞；2）针对目的基因设计20nt的向导RNA。

研究者们目前主要通过电穿孔递送向导RNA和Cas9核酸酶，因为这种方法能在保证细胞存活的同时送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自动化的台式系统，比如Lonza的Nucleofector系统和ThermoFisher的Neon系统。Gladstone心血管病研究所的博士后Mohammad Mandegar奉劝大家，如果不是高通量细胞筛选，请不惜一切代价避免慢病毒递送，因为人多能干细胞似乎会天然沉默慢病毒送入的基因。

抗生素抗性可以帮助我们挑选经过编辑的克隆。研究者们一般将抗生素抗性、荧光报告基因和流式细胞仪结合起来，富集那些转染成功的细胞，把它们铺在单孔或多孔板上。通过追踪细胞形态、多能性标志物和细胞分化能力可以评估细胞的多能性。专家建议每10-20代或者每次细胞操作之后进行核型分析，确保细胞的染色体数量正常。

iPS细胞系如今有许多购买渠道，各大实验平台和公司都提供有相应的服务。此外，iPS重编程方案也非常多。加州大学伯克利分校的细胞生物学家Dirk Hockemeyer表示，我们应当找到最适合自己的方案，在开始CRISPR编辑之前一定要很好地掌握这些细胞。

人多能干细胞VS人肿瘤细胞系

专家们还建议，在着手iPSC之前先用人类癌细胞系试一试CRISPR-Cas9工具。在对iPSC动手的时候牢记一点：操作人iPSC更繁琐、更讲究也更加昂贵。

据介绍，有经验的研究者用大约一个月的时间能学会基础的人iPSC培养。由于新方案和试剂经常出现，操作这些细胞是一个不断学习的过程，哈佛医学院George Church实验室的博士后Susan Byrne说。“我告诉本科生，如果在正确的指导下操作这些细胞，你们将在六个月内成为专家。但人们一开始总是低估了这种技术，”哈佛干细胞研究所的Chad Cowan补充道。

请记住，每一个干细胞系都是独特的。这会影响细胞培养和向导RNA的效果 。“供体和重编程方法都会带来变异，”Byrne说。“有时我们需要对特定干细胞系进行方案优化。”一般来说，就算细胞系很健康、实验方案很完美，人iPSC和ESC的编辑效率也会比癌细胞系低十倍，Johns Hopkins大学医学院的Linzhao Cheng指出。

深入了解你的基因

知己知彼，百战不殆。了解你想要编辑的基因座，认识那些可能转录的序列，可以帮助你设计出最佳编辑方案。举例来说，有些基因在编辑之后仍能表现出一定的生物学活性。在这种情况下，你可能需要切割更大的区域，Byrne说。

敲除VS精确编辑

当你用CRISPR-Cas9切割基因的时候，主要有两个分子通路在执行DNA修复。这两个同时发生的通路决定了基因编辑的精确性。非同源末端连接（NHEJ）负责敲除基因，制造破坏基因功能的小插入/缺失。同源介导修复（HDR）根据供体DNA精确改变核苷酸序列。

不少研究者在进行基因组编辑的时候使用偏向HDR的条件。他们发现，人多能干细胞的编辑效果比传统永生细胞系差，转染100个iPSC只能引入一个正确的改变。这是CRISPR基因组编辑面临的一个主要挑战，不过Hockemeyer觉得自己的团队还能应付。“如果你有很好地组织培养流程，那么挑200个克隆就能获得2个正确克隆。一个学生在三小时内就能搞定，”他介绍道。

Hockemeyer及其同事正在开发新策略，试图让天平向HDR倾斜，比如采用特殊化合物或者其他物种的Cas9。“我认为这个问题很可能未来几年内就能得到解决，”Hockemeyer表示。

Conklin团队开发了一种快速数字PCR测试，用来定量HDR和NHEJ的修复效率。他们的研究显示，在人iPSC和其他一些细胞中，HDR和NHEJ效率之间并没有什么关系。

验证你的基因组编辑

如何证明CRISPR系统完成了正确的切割呢？你可以给细胞提供与编辑基因互补的DNA，这些DNA应该能够挽救相应的细胞表型。如果细胞表型变化很小难以观察，你可以尝试再次编辑这个基因，看看能否使其恢复成野生型，Hocke­meyer说。

研究者们也会抽查自己的基因组，比如对编辑区域进行PCR和Sanger测序。免费算法TIDE（tide.nki.nl/; for Tracking of Indels by DEcomposition）可以在PCR和Sanger测序数据的基础上鉴定目标突变及其发生的频率。

外显子组测序将成为验证基因组编辑的首选方法。“测序可能是对你整个系统最完全的分析。如果这个细胞系要用上十年，那么测序就是你应该做的投资。你需要确保一切都尽善尽美，”Mali指出。同时我们也应当请牢记，遗传学差异会随着时间的推移慢慢累积，任何细胞系都不例外。

脱靶效应并非大问题

针对同一个位点设计两个以上有充分差异的向导RNA，这是防止脱靶编辑一个主要途径。总的来说，脱靶效应对于绝大多数基础研究者来说并不是什么特别大的问题，Cowan认为。CRISPR系统在人多能干细胞中的脱靶效应比癌细胞系少得多，Cheng也表示。但如果真的很担心脱靶，全外显子测序将是你最好的选择。

用CRISPR调控基因表达

如果你指望在多能干细胞中敲除多能性必需基因，那你肯定要失望了。因为敲除这些基因会导致细胞死亡。在这种情况下，我们只能选择下调（或上调）基因的表达水平。研究者们为此打造了失去催化活性的dCas9，dCas9能到达向导RNA指定的位点，但无力对DNA进行剪切。用dCas9抑制转录的策略被称为CRISPRi，用dCas9激活转录的策略被称为CRISPRa。

基因表达控制和基因编辑之前的主要区别在于，基因表达控制并非永久性改变基因组。你可以干扰细胞沉默基因，然后再逆转这种抑制。此外，与CRISPR-Cas9相比，CRISPRi和CRISPRa的脱靶效应更小。

CRISPR调控基因表达也存在一定的挑战。举例来说，设计一组可靠的向导RNA很难，Mali说。在理想情况下，向导RNA应当避开紧紧缠绕核小体的基因组区域。但有时候我们想要靶标的位点就在这些区域里。

将CRISPRa和CRISPRi送入人多能干细胞也比较复杂。“使CRISPRa和CRISPRi进入70-80%的细胞依然很难，除非你使用病毒来递送。通常我们说的都是30-40%的细胞，”Cowen指出，他正在用CRISPRa激活和验证报告基因。这种方法对他很有帮助，因为iPSC很难分化成他想要的肾内皮细胞。

（作者：Kelly Rae Chi/生物通编译）