NEB经验分享:分子克隆需要注意的8个问题[心得点评]

【字体: 时间:2017年03月06日 来源:NEB

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  无论选择了何种方法,以下要点都可以提高实验效率,提高克隆成功率。本文总结了 NEB 40 多年来的分子克隆经验,谨此献给奋战在实验室的同学、朋友们。

传统的分子克隆实验使用限制性内切酶从供体 DNA 中切下插入片段,同时将载体线性化,产生互补的末端。纯化后,插入片段和载体连接成为一个重组载体,将该载体转化进入 E. coli 宿主菌中。此外,PCR 产物也可用于制备载体和插入片段,并可采用多种技术将两者连在一起,例如标准的 DNA 连接技术或是同源重组技术。

无论选择了何种方法,以下要点都可以提高实验效率,提高克隆成功率。本文总结了 NEB 40 多年来的分子克隆经验,谨此献给奋战在实验室的同学、朋友们。

1 精心设计实验

注意连接处的序列,以及对翻译序列的阅读框的影响。在设计包含酶切位点近似序列的引物之前,先检查载体和插入片段内部的酶切位点(我们建议使用 NEBcutter.neb.com 的酶切位点分析软件 NEBcutter)。确认载体的抗生素选择标记与所选宿主菌是否相容。

2 使用无污染的正确浓度DNA

确保你的 DNA 来源无污染,不含有核酸酶和多余的酶活性。使用商品化的离心柱来纯化起始 DNA。在操作 DNA 之前,应完全去除所有的溶剂,例如苯酚,氯仿和乙醇。使用无盐离子的缓冲液将 DNA 从离心柱上洗脱下来,以避免对下游实验(酶切或是 PCR 扩增实验)造成影响。进行该实验时需使用足量的 DNA。酶切反应通常需要准备 0.2-2.0 μg 的 DNA,而 DNA 作为 PCR 模板时通常几纳克就足够了。

3 谨慎进行酶切实验

反应体积应便于进行下游操作(例如应比凝胶上样孔体积小一些)。一般的克隆反应,通常在 20-50 μl 之间。加入的内切酶体积应不超过总反应体积的 10%,以确保甘油浓度低于 5%;这是降低星号活性(特异性降低或改变)的重要方法。

4 注意末端序列

克隆实验中,假设待连接的 DNA 末端是互补的,经过酶切的末端无需进一步修饰即可用于连接实验。如果末端不互补,则需要用末端平齐化试剂,磷酸酶等进行修饰。如果使用了 Taq DNA 聚合酶(NEB #M0273)进行扩增,则 PCR 产生的用于克隆的 DNA 末端会在 3´ 末端加入一个腺嘌呤(A)残基。高保真 DNA 聚合酶,例如 Q5(NEB #M0491),产生平末端。除非引物的5´ 端进行了磷酸化,使用标准的商品化引物 PCR 产生非磷酸化的片段。PCR 产物在与去磷酸化的载体连接之前,需要用激酶处理在 5´端加入一个磷酸基团。

5 连接载体:插入片段之前,纯化 DNA这一步可以使用凝胶电泳或柱纯化的方法。

目的 DNA 从不需要的原始载体和/或其它 DNA 片段中分离出来,能够大大改善你的克隆结果。连接前跑琼脂糖凝胶电泳确认酶切的 DNA 片段。对于单一产物,取小量的酶切产物跑胶,剩余的进行柱纯化回收。当产生了多种片段,只有其中一种片段用于实验时,将片段进行跑胶,在紫外灯下切出目的片段。使用长波长(365 nm)的紫外灯可减少辐射对 DNA 片段带来的损伤。使用胶回收试剂盒或 β-琼脂糖酶 I(NEB #M0392)从切下的琼脂糖胶块中回收 DNA 片段。

6 定量回收产物

简单的定量方法,如使用质量标准为参照的凝胶电泳,或者微量分光光度计的光谱学定量(例如 NanoSpec®),确保用于下游连接反应的样本量在合适的范围。

7 按照生产商的指南进行连接反应

使用传统方法克隆时,请遵从连接酶生产商的推荐指南。如果推荐插入片段和载体的摩尔比为 3:1,则先按此建议进行实验。质量比与摩尔比是不同的概念(除非插入片段和载体大小质量相等)。连接反应通常很快,除非克隆实验需要得到高复杂度的文库,并要求获得所有可能产生的连接产物,否则没有必要进行长时间温育。

按照生产商的指南进行 PCR 克隆中的连接反应和无缝克隆。如果你第一次进行克隆实验,为了获得理想的结果请严格遵循推荐的实验体系。

8 选择满足需求的感受态细胞

某些实验室自己制备感受态细胞,其转化效率很少能够达到商品化感受态细胞的高水平。商品化感受态细胞节约时间和资源,让克隆有更好的可重复性。

欢迎索取分子克隆的更多技术指南或产品资料

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