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高分文献中的定量Western Blot是如何实现的?

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年3月8日 来源:基因有限公司

摘要:

  Western Blot 是分子生物学中研究蛋白的经典方法,被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白表达量。传统的Western Blot被认为是定性或半定量Western Blot,那么高分文献中的定量Western Blot(Quantitative Western Blot)是如何实现的?小编和您一起来了解定量Western Blot。

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Western Blot 是分子生物学中研究蛋白的经典方法,被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白表达量。传统的Western Blot被认为是定性或半定量Western Blot,那么高分文献中的定量Western Blot(Quantitative Western Blot)是如何实现的?小编和您一起来了解定量Western Blot。首先需要明确:什么是定量Western Blot?为什么要对Western Blot进行定量分析?如何实现定量Western Blot?

一、什么是定量Western Blot?

定量Western Blot:是指信号和靶蛋白量成很好的线性比例关系,如果用标准蛋白做标准曲线可以得到目的蛋白准确的定量信息,与Real-Time PCR(以下简称qPCR)有异曲同工之妙。文献中定量Western Blot使用最多的成像技术是LI-COR Odyssey双色近红外荧光成像,并且经查证定量Western Blot领域中LI-COR Odyssey有超过一万多篇文献数量(HighWire)。

二、为什么要对Western Blot进行定量分析?

分子生物学研究中,核酸水平的研究常用PCR的方法进行定性或半定量研究,用qPCR的方法进行定量分析;而在蛋白质水平的研究,传统的Western Blot仅能进行定性或半定量研究,想要实现准确的定量研究,必须使用定量Western Blot的方法。很多发表的文章中都采用qPCR方法对mRNA表达水平进行定量分析,并同时用LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法对蛋白表达水平进行定量分析。如2015年发表在Cell Stem Cell上的一篇文章(介绍神经精神疾病建模过程使用基因条件敲除,发现NRXN1中杂合突变引起突触传递缺陷现象,证明人类神经元中杂合NRXN1突变会伴随CASK蛋白表达上调),作者分析了mRNA水平包括CASK mRNA(使用定量PCR方法,图A)和蛋白水平的变化(使用LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法,图B),文章显示cKO和cTr NRXN1突变体iN细胞中CASK蛋白水平增加60%-80%,定量PCR和定量Western Blot 结果相辅相成,与其他方法共同揭示了NRXN1的杂合失活直接损害人类神经元突触功能。

ChangHui Park et al.,2015,Cell Stem Cell) 1。


 
A: 总mRNA水平定量分析用qRT-PCR方法
B: 蛋白表达差异定量分析定量LI-COR Odyssey 进行定量Western Blot成像分析

2016年发表在Neuron 上的文章(介绍一个灵长类lnc RNA-lncND在神经元发育过程中调节Notch信号通路)中,内源性NOTCH-1和NOTCH-2 mRNA(定量PCR方法)和蛋白的表达(LI-COR Odyssey 定量Western Blot方法)在miR-143-3p模拟物存在下显着下调(图D和F)。Notch信号通路的下游靶标HES1和HEY1也被下调(图E),定量PCR和定量Western Blot方法证实miR-143-3p对该通路的影响。(Rani et al l.,2016, Neuron)。


 
D、E : mRNA水平验证miR-143-3p对于靶标Notch1和2表达的调节作用
F、G: 蛋白表达水平验证miR-143-3p对于靶标Notch1和2表达的调节作用

三、如何实现定量?

1.:获得稳定的Western Blot信号

选用近红外荧光成像获得稳定的近红外荧光Western Blot信号,意味着重复性高、定量数据准确。与化学发光Western Blot的动态信号(信号受曝光时间影响,也受底物浓度、底物类型、温度等多种因素的影响)不同,稳定的近红外荧光信号不受曝光时间影响,信号与浓度成比例,能准确定量见图一。


 
图一

2007年发表在PNAS文章作者比较了不同的Western Blot 检测方法的定量准确性问题。作者需要定量分析三种感兴趣的蛋白p53、Hdm2、 Hdmx的表达水平,其中Hdm2、 Hdmx两种蛋白丰度轻微的波动就会对p53有明显的调控作用,所以作者设置了不同的Western Blot 检测方法--化学发光和近红外荧光法,来评估那种方法定量更准确,结果证明Odyssey 近红外荧光Western Blot结果更准确,线性范围更宽,而ECL化学发光法目标蛋白的线性范围有限(高丰度蛋白更容易过曝),定量准确性和重复性也没有近红外荧光检测法好(Wang et al,. Salk Institute,PNAS )。


 
图二:两种不同的Western Blot 检测方法Odyssey 近红外荧光法和ECL化学发光法 定量准确性比较,Odyssey 近红外荧光Western Blot结果更准确,线性范围更宽

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