新颖的荧光原位杂交技术在临床中大放光彩[创新技巧]

每年，全球大约新发64.5万例头颈部癌。在这种疾病中，口腔、鼻子或喉咙中的细胞生长开始失控。造成疾病的一个原因是人乳头瘤病毒（HPV）的感染，不过，这也是一个好消息，因为由HPV引起的癌症通常比较容易治疗。

然而，问题又来了。人们很难确定哪种癌症由HPV感染引起。研究表明，HPV感染与宫颈癌、口咽癌、皮肤癌等多种癌症都存在关联。临床实验室通常依赖标志物P16的过表达来判断。P16蛋白是一种细胞周期调节蛋白。

据Advanced Cell Diagnostics（ACD，Bio-Techne旗下品牌）的首席科学家家Xiao-Jun Ma介绍，现在有一种更好的方法。利用ACD的RNA原位杂交RNAscope技术将荧光探针与病毒基因组的转录本相连接，研究人员可更直接地观察病毒活性。最近，徕卡的BOND-III全自动染色机也可以开展这种RISH检测。

DNA的荧光原位杂交（FISH）在临床上有着悠久的历史。人们通常用它来观察癌症中常见的基因组重排，或在产前的唐氏综合征检查中检测额外的染色体。如今，RISH也开始在临床中发挥作用。它让研究实验室能够精确定位编码和非编码RNA，从而探索转录控制和RNA剪接的机制。

DNA的FISH

当科学家已经知道他们要寻找什么样的基因组改变时，比如拷贝数变异或易位，他们会选择使用FISH技术，Empire Genomics的CEO Anthony Johnson说。这家公司生产FISH探针。“FISH可以鉴定这些结构变异，其分辨率达到5-10 kb。”当然，它通常无法区分更小的畸变。

FISH探针通常由荧光标记的DNA链组成，每条的长度大约是200 bp，它与目标DNA的互补序列结合产生荧光信号。原位杂交就是通过这些探针来标记固定细胞或组织中的特定基因序列。

探针的来源也许是多种多样的：质粒、细菌人工染色体（BAC）、粘粒或合成DNA。据Enzo Life Sciences的生化主管Jack Coleman介绍，BAC是一种受欢迎的起始材料。诊所经常购买探针，每个反应的费用大约是25美元。不过，有些科学家希望省钱，或买不到商业化探针，也会自己合成和标记。

安捷伦科技负责癌症遗传学的全球营销副总监Jimmy Jin表示：“使用BAC作为起始材料也有局限性。”并不是人类基因组的所有部分都存在BAC克隆。其次，基于天然DNA的BAC包含令人厌烦的重复序列，如Alu序列。富含重复的探针与基因组杂交，会产生高背景信号。“阻断含有重复序列的样品可能有帮助，但也会抑制科学家想要看到的信号，”Jin说。安捷伦的SureFISH探针由完全合成的DNA制成，避免了重复序列，可带来高特异、低背景的信号。

RNA的FISH

将特异性探针与RNA结合，无论是编码的还是非编码的，研究人员能看到它在细胞中的位置。LGC Biosearch Technologies的产品经理Marcela Soruco表示：“如果探针是针对未加工RNA中的内含子，那么他们可以找到转录位点。”这家公司的Stellaris探针最多包含48个合成的寡核苷酸，与目标序列串联结合。

ACD的RNAscope探针的作用原理则有所不同。这家公司根据配对探针的近似形状，将其设计称为“双Z”。每对探针并排放置，这样两个Z的底部就与RNA目标对齐。顶部则包含标准位点，吸引多个荧光标记的探针结合，但只有两个Z都存在时才有效。通过这种方式，RNAscope既是特异性的，又能够将少量信号扩增成强的荧光信号。

据Xiao-Jun Ma介绍，ACD新推出的BaseScope检测更加灵敏。它只需要一对Z就能产生信号，并且能够检测单碱基突变，或因选择性加工而产生的单个剪接位点。这种检测也能用来检查CRISPR/Cas9或其他技术实现的基因编辑。

“实现RNAscope检测的自动化是向临床迈进的重要一步，”Ma表示。例如，RNA ISH可以应用在伴随诊断上，预测特定药物是否适用于患者。ACD也正与Merrimack和拜耳制药公司合作，他们计划将这项技术用于癌症药物的伴随诊断。

到目前为止，Stellaris的产品主要应用在基础研究中，比如最近Zika病毒RNA的复制1。它们也用在植物生物学中，最近就有科学家利用RISH来研究开花基因座C（FLC）的调控2。作者标记了FLC转录物，它们编码的蛋白质能抑制开花，而反义转录物能抑制FLC表达并促进开花。利用Stellaris RISH，研究人员看到转录每次只能朝着一个方向进行，反义转录物似乎阻止了正向的转录。

这项研究的共同作者，英国伯明翰研究所的Susan Duncan表示，她喜欢这种技术，因为她可以确切了解RNA的位置。“这非常直接。实际上，这就是眼见为实，”她说。

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（作者：Amber Dance / 生物通编译）

参考文献
1. Aagaard, KM, et al., “Primary human placental trophoblasts are permissive for Zika virus (ZIKV) replication,” Sci Rep, 7:41389, 2017. [PMID: 28128342]
2. Rosa, S, et al., “Mutually exclusive sense-antisense transcription at FLC facilitates environmentally induced gene repression,” Nat Commun, 7:13031, 2016. [PMID: 27713408]