华人先锋《Nature Methods》利用CRISPRi绘制遗传互作图谱

【字体: 时间:2017年05月11日 来源:生物通

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  2013年,亓磊研究组在Cell发布论文介绍了一种基于Cas9的基因调控方法。他们将这个系统称为CRISPRi,在此基础上,亓磊研究组深入研究,研发出了一种可以用于绘制哺乳动物细胞中的遗传相互作用的CRISPR干扰(CRISPRi)筛选平台。

  

生物通报道:斯坦福大学亓磊(Lei Stanley Qi)教授早年毕业于清华大学,现任斯坦福大学生物工程学、化学和系统生物学系的助理教授,近年来他在CRISPR研究领域取得了一系列突破性进展,比如第一次采用CRISPR-Cas9系统的变种技术,改变了读取诱导多能干细胞(iPSCs)基因组的方式(由此入选了生物通的2016年生命科学风云人物)。

作为基因组靶向改造(敲除和敲入)的遗传学手段,基因组编辑技术历经ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9,已发展成为自20世纪70年代生物技术时代开启以来最重要的基因工程技术。因没有物种限制、简单、高效,以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、猪、羊、水稻、小麦和拟南芥等动植物(细胞)以及细菌等微生物的基因组靶向改造,成为后基因组时代的功能基因组研究、动植物品种改良、疾病模型建立以及基因治疗等不同领域研究与应用的利器。

2013年,亓磊研究组在Cell发布论文介绍了课题组开发的基因沉默技术。研究人员将CRISPR用于基因表达序列特异性调控的平台,研发出了一种基于Cas9的基因调控方法。他们将这个系统称为CRISPRi,并指出这种RNA导向的DNA识别平台是基因组范围内基因表达选择性抑制的一种简单的新方法。

今年3月,亓磊研究组发表论文,借助于CRISPR-Cas9基因编辑方法,筛选上千个基因突变组合,寻找可以选择性杀死癌细胞的突变,从而找到癌症的弱点。研究人员设计了具有两种导向RNA的CRISPR -Cas9系统:1)靶向一个在癌症中通常发生突变的抑癌基因;2)靶向一个受到某种癌症药物破坏的基因。研究人员针对三种实验室细胞系(人宫颈癌细胞,肺癌细胞和胚胎肾细胞)中的73个基因,总共150,000种基因组合研发了这一新系统,然后他们检测了细胞的生长和死亡。结果证明,这种方法能揭示超过120种新的合成致死相互作用。CRISPR又一值得关注的华人学者 Nature子刊借助基因编辑发现癌症弱点

在此基础上,亓磊研究组深入研究,研发出了一种可以用于绘制哺乳动物细胞中的遗传相互作用的CRISPR干扰(CRISPRi)筛选平台。他们利用单链或双链导向RNA(sgRNA)池分别干扰个体基因或基因对的表达,从而靶向了107个人类细胞中的染色质调节因子,并且研究人员通过针对单个sgRNA或sgRNA对相对富集的分析,描述了遗传相互作用的定量特征,比对了蛋白质-蛋白质相互作用数据,从而揭示了染色质调节的功能图。

CRISPRi技术能抑制指定目标的转录,不论是编码还是非编码的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9(dCas9),dCas9能到达引导RNA指定的位点,但无力对DNA进行剪切(Cell, 152:1173-83, 2013)。当dCas9结合到基因组的时候,会阻断转录机器的结合,阻止这一过程的进行。之后改良版CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子(KRAB)的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展,使其难以得到转录。CRISPRi的可逆性是一种特色,不过这也限制了该技术的应用。一些研究者正在利用KRAB结构域让dCas9结合得更加稳定,以实现永久抑制特定位点的转录。人们可以通过这种方法研究表观遗传学标记的跨代遗传。

最新这项研究构建了一个靶向参与染色质调控的107个基因(平均每基因3个sgRNA)的单sgRNA文库,这一文库还包括41个阴性对照sgRNA和5个阳性对照sgRNA,前者不会靶向人类基因组的位点,后者则靶向已知能对细胞增殖产生强烈影响的因素。研究人员利用这一文库生成了一个可以同时靶向基因对的双链sgRNA文库。将这两个文库转染到HEK293-TetON-dCas9-KRAB细胞中,得到了两个包含单个或者两个基因干扰的细胞池,这样再通过测序,分析细胞适应度和定量表型读数。

这种方法相比于相比于RNA干扰(RNAi)具有多个优势,比如RNAi靶向的是成熟的RNA,CRISPRi的作用是阻止转录的起始,因此虽然CRISPR系统也存在脱靶效应,但要比RNAi少得多,因为CRISPRi必须在转录起始位点附近才能发挥作用。此外比较于Cas9介导的基因敲除,CRISPRi敲除并不会在等位基因中出现异质性,而且可以进行获得性功能筛选,这些都有助于后续的研究。

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(生物通:万纹)

原文标题:

Genetic interaction mapping in mammalian cells using CRISPR interference

 

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