利用数字PCR,在液体活检中高效筛查突变[创新技巧]

【字体: 时间:2017年05月12日 来源:生物通

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  人们尝试用血液或其他体液中的游离DNA(cfDNA)来定量癌症标志物。这种液体活检方法避免了侵入性的外科手术,让更多癌症患者受益。目前,定量cfDNA的主要方法有新一代测序(NGS)和定量PCR(qPCR),不过,它们也都存在挑战。

了解与疾病相关的突变,特别是与癌症相关的突变,可以帮助预测结果并选择疗法。然而,传统的组织活检却限制了这种个性化治疗的能力。通过外科手术,我们可以对肿瘤进行分期,但若要跟踪治疗效果或疾病进展,那可办不到。此外,对于一些癌症,比如转移性乳腺癌或前列腺癌,组织活检几乎不可行。

于是,人们尝试用血液或其他体液中的游离DNA(cfDNA)来定量癌症标志物。这种液体活检方法避免了侵入性的外科手术,让更多癌症患者受益。目前,定量cfDNA的主要方法有新一代测序(NGS)和定量PCR(qPCR),不过,它们也都存在挑战。

NGS和qPCR往往难以检测5%以下的突变,并且需要的样品量比较多。NGS的流程复杂,周转时间长,且检测成本高;qPCR虽然更为经济,但对临床样本中常常存在的PCR抑制剂敏感。

于是,研究人员纷纷拿起新式武器 – 微滴式数字PCR(ddPCR™)。这种技术将样品分液,并利用终点PCR扩增感兴趣的目标,从而克服了这些挑战。ddPCR可实现高度灵敏的核酸绝对定量,不容易受到PCR抑制剂的干扰,并且比NGS的流程更加简单和经济。

人们已经利用ddPCR来定量各种癌症的驱动突变和耐药突变,包括肺癌、乳腺癌以及黑色素瘤。研究结果表明,这种技术的阳性预测值高达100%,周转时间仅为2-3天,且灵敏度明显提高。

在5月初发表的一项研究中,英国癌症研究所的研究人员利用ddPCR技术开发出一种血液检测,可确定哪些前列腺癌患者将从靶向治疗中受益。他们测定了循环肿瘤DNA中雄激素受体(AR)基因的拷贝数,并与患者的生存期相关联。(延伸阅读:前列腺癌患者选择哪种靶向治疗,验一下血便知晓

对于非小细胞肺癌(NSCLC),Dana-Farber癌症研究所也开发出一种基于ddPCR的液体活检分析,可通过简单的血液检测准确鉴定两个关键基因的突变。这种检测有望作为临床工具,帮助确定哪些患者将受益于靶向治疗药物。2016年,这项成果发表在《JAMA Oncology》杂志上。(延伸阅读:肺癌液体活检新成果

看了这些成果,也许你也正摩拳擦掌,准备大干一场。那么,如何利用ddPCR检测与癌症相关的突变?这里以KRAS突变为例,介绍了一些工具和方法。

检测低至0.2%的突变

作为EGFR信号通路下游最重要的效应因子,KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。KRAS基因的突变,与结直肠癌、肺癌等多种癌症存在关联。突变基因编码异常蛋白,刺激恶性肿瘤细胞的 生长和扩散;并且不受上游的表皮生长因子受体(EGFR)的信号影响,因此针对EGFR的治疗效果不佳。Bio-Rad的ddPCR KRAS G12/G13 Screening Kit可在单个反应中筛查多个KARS突变以及野生型KRAS。

此试剂盒采用FAM标记的突变型探针和HEX标记的野生型探针。通过探针的标记,在2D荧光图可看到4个可能的群体:(1) FAM和HEX阴性,表明液滴不含有KRAS基因;(2) HEX阳性,表明液体含有野生型KRAS;(3) FAM阳性,表明含有一个或多个KRAS突变;以及(4) FAM和HEX双阳性,表明野生型和突变型KRAS都存在。

之后,QX200微滴式数字PCR系统的软件可以定量这些事件,并提供绝对的拷贝数和丰度。如图1所示,丰度低至0.2%的突变也能轻松定量。

使用ddPCR的一个主要优点在于,定量不是相对的。微滴式数字PCR计算事件的绝对数量,因此可以确定检测极限和最低起始量,以便达到所需的灵敏度。在连续监控或比较不同患者的治疗效果时,这可以更准确地比较肿瘤负荷,因为所测得的丰度不是相对的。

图1:对7个可行动的KRAS突变进行多重检测(图片来自Bio-Rad)

经过实验证实,ddPCR KRAS G12/G13 Screening Kit也能够检测患者cfDNA样品中的KRAS突变(图2)。这些患者的血浆样品购自Conversant Bio和ProMedDx,之前已通过FFPE基因分型被分为KRAS突变阳性或阴性。

图2:对患者游离DNA样品中的KRAS突变进行多重检测(图片来自Bio-Rad)

总的来说,利用微滴式数字PCR,研究人员可以通过简单而快速的流程来定量cfDNA样品中频率低至0.2%的突变,了解疾病进展和治疗效果。通过多重检测,在单个反应中即可检测几种已知的癌症驱动突变。

据了解,除了ddPCR KRAS G12/G13 Screening Kit,Bio-Rad还提供了几款试剂盒,能筛查常见的NRAS和BRAF突变以及KRAS Q61突变。如果这些不能满足你的需求,那么可以自己设计或从Bio-Rad购买其他的检测。

对于那些存在大量驱动突变的癌症,微滴式数字PCR同样有用。在这种情况下,NGS可以带来全基因组的视图,让人了解患者特异的突变,而更经济的ddPCR可以在整个治疗过程中追踪这些生物标志物。(生物通 余亮)

了解Bio-Rad的微滴式数字PCR系统及突变筛查试剂盒

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