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靶向富集:让测序经费花在刀刃上[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年5月22日 来源:生物通

摘要:

  以外显子组为例,它仅占基因组的1%到2%,但却含有85%的已知致病突变。这么看来,与全基因组测序(WGS)相比,外显子组测序相当于减少了98%的测序工作。不用说,靶向测序集合(panel)更是大大减轻你的负担。在此,我们看看研究人员是如何开展靶向富集的,以及他们研究时的考虑因素。

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尽管新一代测序(NGS)的出现让测序成本一降再降,但有时候,整个基因组的测序并不是必需的,甚至会适得其反。相反,将注意力放在其中一小部分,才是明智的。如今,通过靶向富集策略,人们能够减少某些项目的测序量,加快进度并降低成本,同时减轻数据分析的负担。

以外显子组为例,它仅占基因组的1%到2%,但却含有85%的已知致病突变。这么看来,与全基因组测序(WGS)相比,外显子组测序相当于减少了98%的测序工作。不用说,靶向测序集合(panel)更是大大减轻你的负担。在此,我们看看研究人员是如何开展靶向富集的,以及他们研究时的考虑因素。

两种策略

目标富集可以通过两种策略来实现:捕获或扩增。这也就是说,在一个基因组DNA的库中,你可以钓到所需的DNA,也可以选择性地合成它。目前的许多技术大多是采用这两种模式,有时是将它们相结合。

捕获法通常是从NGS的文库制备开始的,比如打断DNA,将接头与片段连接,并开展PCR扩增。之后,使用与感兴趣的片段互补的生物素化探针,让其与DNA杂交,再用链霉亲和素筛出。通过第二轮PCR释放互补链,然后就可以测序了。

基于杂交捕获的富集是以类似芯片的形式开展的,但主要采用溶液形式,“溶液更加方便,”罗氏测序部分的市场部经理Mike Leous解释道。“据我所知,现在已没有人使用固态形式了。”

目标富集也可以利用多重PCR的策略来开展,这称为扩增子方法。将DNA酶切消化,利用探针来捕获两端以形成环状的DNA模板,或使用基因组或随机剪切的DNA模板。之后,利用特异性引物来扩增感兴趣的DNA区域,形成高度富集的DNA库。

性能如何?

不同的供应商提供的外显子组富集产品略有差异,有些产品包括3’或5’非翻译区,而有些覆盖非编码RNA。探针的长度和密度以及所用的算法都略有不同,因此覆盖范围也不完全相同。那么在文库制备之前,还是有必要好好选择一番。

费城儿童医院的病理学教授Dimitrios Monos提醒到,如果你的研究对象是癌症,需要了解可能存在倒置或缺失的区域,那么目标区域应当包含非翻译DNA。

罗氏NimbleGen提供各种各样的DNA集合。据Leous介绍,他们的外显子组产品除了可富集人类基因组的编码区,还可以覆盖大约4000个医学相关的基因。如果你只想要前列腺癌相关基因,也没问题。一切都是可以定制的。

NEB的产品营销经理Andrew Barry则认为,溶液型的杂交比较适合大的区域,从Mb大小的区域到外显子组(30-60 Mb)。当范围缩小时,你往往会发现特异性的损失,开始引入大量的off-target reads。多重PCR的方法则更适合于各种小型的重点集合。它们往往更快,对样品起始量的要求也更低,不过“扩展内容会比较困难”。 Barry认为,一些新颖的方法,如安捷伦的HaloPlex、Illumina的TruSeq Amplicon和NEB的NEBNext Direct试图填补缺口。

当然,市场上也有丰富的溶液型杂交集合,适用于小型区域。同时,赛默飞世尔科技的Ion AmpliSeq Exome RDY S5 Kit也利用超高的多重PCR来富集外显子组,以便在Ion S5™系统上测序。

两难之选

在临床研究中,是开展WES,还是开展WGS,科学界一直存在争论。有人认为,寻找常见突变是一回事,寻找稀有突变又是另外一回事了。对于WGS,基因组覆盖度为20-30倍,“你只能找到频率在50%或以上的生殖系突变,”Barry指出。“当你开始研究液体活检的游离DNA,你需要非常高的覆盖度,以便找到0.1%的突变。”

然而,罕见病基金会的博士后Janine Meienberg表示,她将不再开展目标富集,因为靶向区域不能被完全覆盖。不充分的靶向富集和文库制备中的PCR将不可避免地引入偏倚,GC含量越高,WES的覆盖度就越低。她倾向于采用无PCR的WGS,不过缺点是需要更多的起始材料。

有时候,问题是发现了一些不能直接定位到参考基因组的序列,比如易位等结构改变或高度多态性区域。Monos利用他的区域特异性提取(RSE)方法来获得长度超20 kb的片段,并结合长读长测序方法,绘制出主要组织相容性复合物(MHC)的4 Mb片段。

还有时候,问题是根本没有参考基因组,比如许多农业上重要的生物。在这种情况下,RAPiD Genomics的销售经理Orin McCormick表示,高达20万个不同区域的定制设计集合可能是WGS的一个完美替代。“当你考虑对松树进行基因分型时,WGS并不是一个经济的选择。”

富集,还是不富集,这是个问题。如果要富集,怎么选择?你可以先想想几个问题:我的目标区域是什么?我要捕获多少个区域?我有多少起始材料?我有多少个样品?同时考虑你的经费和流程,以及对各种性能的要求,比如特异性、均一性和灵敏度。当然,你也可以看看其他类似项目的同事是怎么做的。

了解Illumina的各种靶向富集解决方案

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

(http://www.ebiotrade.com/)
版权所有,未经书面许可,不得转载

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