液体活检分析,怎么少得了流式细胞仪?[创新技巧]

【字体: 时间:2017年05月09日 来源:生物通

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  个性化医疗的热潮以及微创的采样程序,让液体活检(liquid biopsies)成为转化研究的新宠。血液、痰液、尿液等体液中也许隐藏了重要的信息,让你了解某个人是否会心脏病发作,患上阿尔茨海默病,或者特定疗法对他的癌症是否有效。

个性化医疗的热潮以及微创的采样程序,让液体活检(liquid biopsies)成为转化研究的新宠。血液、痰液、尿液等体液中也许隐藏了重要的信息,让你了解某个人是否会心脏病发作,患上阿尔茨海默病,或者特定疗法对他的癌症是否有效。

为了获得这样的证据,研究人员正在千方百计寻求各种资源,如游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、代谢产物、细胞外囊泡以及细胞本身。各种各样的技术和仪器都被委以重任。在此,我们来看看流式细胞术可在液体活检中发挥什么样的作用。

为何上流式?

众所周知,流式细胞术是一种功能强大的高通量技术,可以根据荧光和光散射特性来分析颗粒。利用一组荧光标记的抗体,不同的表面和内部标志物可被标记;前向散射可反映颗粒的大小,而侧向散射可粗略表示其粒度。

举个栗子,对于白膜层中的细胞,你可以用针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞角蛋白(CK)和CD45分子的抗体进行染色。然后,在流式细胞仪上检测这些细胞,并对表达CK和EpCAM但不表达CD45(白细胞的标志物)的稀有细胞进行定量。这就是CELLSEARCH的原理,它是一台经过FDA批准的系统,可以通过简单的血液检测来鉴定循环肿瘤细胞(CTC)。

南加州大学凯克医学院的主任Julie Lang指出,流式细胞术只是大海捞针的几种方式之一。在过去几年,根据细胞表面标志物(如EpCAM)分离CTC的产品已经推出,而其他产品则是基于大小、变形性等物理性质。不过,由于流式分析需要排队和准备,Lang的团队已使用Angle Parsortix系统来搜索CTC。“RNA迅速降解,因此如果标本放了几个小时,那就不再适用于癌症研究,”Lang解释说。

不过,宾夕法尼亚大学的病理学教授Jonni Moore认为,流式细胞术的多维度赋予了无以伦比的特异性。某些肿瘤细胞的EpCAM可能下调,因此不符合CELLSEARCH的标准。“有时,标志物会在非肿瘤细胞上广泛表达,而物理分类也并非100%准确,因此会造成假阳性结果,”Moore说。人们使用流式细胞术的主要原因就是查看更多标志物,比如,确保假定的乳腺癌细胞来自乳腺。

CTC是从原发性和转移性肿瘤中脱落的,被认为是转移性疾病的罪魁祸首。有了流式细胞仪,研究人员能够追踪癌症的演化,也许从中能够获得与活检不同的治疗启示。同样地,通过长时间观察CTC,他们也能了解治疗的效果如何。当然,Moore认为,流式细胞术的特异性加上基因组学的灵敏度,这才是理想的组合。

仪器选择多

许多研究人员在流式分析之前,选择富集EpCAM+细胞,或去除CD45+细胞。这一般是通过磁珠来完成的。BD Biosciences正在开发FACSFocus仪器,它将利用免疫磁性分离和声波洗涤。“没有离心,这也意味着我们不会丢失细胞,”Moore说。

Moore及其同事已经利用这款仪器来检测和鉴定循环的胰腺癌细胞,它们具有转移的潜力。“你无法通过流式以外的技术来实现这一点。芯片技术现在不大适合,但未来不好说,”她说。

目前,流式细胞仪正在快速发展。“越来越多的小容量细胞分析仪、芯片型分析仪,让我们能够检测少量样品,无论它们是来自血液,还是组织本身。”

据加州大学洛杉矶分校的神经学家Karen Gylys介绍,一些新型的流式细胞仪,比如Apogee Flow Systems的Micro Flow Cytometer,关注小的颗粒。“至少从理论上说,它处在外泌体(exosome)的范围内,大约是100 nm。”其他供应商也在开发类似的仪器,虽然不是专用的,但也能区分小的颗粒。

细胞外囊泡

循环的细胞外囊泡(ECV)就很小。它们可能含有microRNA、mRNA、DNA以及其他核酸和蛋白质,而它们的膜富含某些表面标志物,如CD9、CD63和CD81。ECV一度被认为是细胞碎片或废物,但其实也是细胞间通讯的一种手段。尽管目前有多种说法,但ECV、EV、外泌体这些术语大多指的是同一种东西。

作为癌症、脑损伤、心血管疾病以及其他疾病的标志物,ECV已经被广泛研究。不过,流式分析只参与了一小部分。使用传统的流式分析仪研究ECV的困难在于,样品制备太麻烦了,通常涉及到超速离心。此外,由于颗粒很小,流速需要小心控制。

不过,随着新的仪器、试剂和信息学工具的出现,这种情况应当会有所改变。一些供应商推出了完整外泌体的分离试剂盒。比如,美天旎最近推出了MACSPlex Exosome Kit,它通过磁珠利用广谱的标志物来捕获外泌体。通过流式细胞分析,在单个实验中就能鉴定30多种外泌体表面标志物。

尽管目前分析ECV的特征还是挑战重重,但Moore认为,“ECV真的是一座金矿。”他预测,“两年内,对于生物标志物等研究,人们对ECV的兴趣将超过细胞。”无论这是否成真,但基于流式细胞术的液体活检研究无疑有着光明的前景。

深入了解赛默飞独特的Attune NxT流式细胞仪

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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