新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测的应用

这几年各领域关于外泌体的研究很广泛，但目前的外泌体实验技术尚未成熟，需要研究的课题还很多。因此，本文就Wako公司为解决外泌体实验技术中出现的各种问题而研发的新型外泌体分析工具进行说明。

前言

外泌体是由各种细胞分泌的直径在30-100nm之间的膜囊泡。因外泌体内含mRNA、microRNA等核酸和蛋白质，对相邻细胞具有信息交换功能，且作为细胞间信号传导的通讯工具和作为癌等各种疾病的生物标记而备受关注[1][2]。这几年各领域关于外泌体的研究很广泛，但目前的外泌体实验技术尚未成熟，需要研究的课题还很多。例如，外泌体纯化方法中，超离心分离法和多聚体沉淀法（市售试剂盒），由于容易混入多种杂质，在后续实验中会增加很多障碍；抗体亲和法和密度梯度离心法虽可获得高纯度外泌体，但是不能获得完整状态的外泌体，无法分析外泌体完整状态下的生理功能。另一方面，检测外泌体常用的免疫印迹和ELISA，存在着需要大量外泌体样本和由于标记蛋白量少而导致的检测困难问题。

因此，本文就Wako公司为解决外泌体实验技术中出现的各种问题而研发的新型外泌体分析工具进行说明。

磷脂酰丝氨酸亲和性新型外泌体纯化法

外泌体膜虽含有分泌细胞源蛋白质和脂质，但在活细胞中会随着翻转酶的移动而导向细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸（PS），在外泌体中却是暴露在外泌体膜外侧[3]。另外，作为通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4(Tim4)蛋白质通过细胞外域的IgV结构域，与钙离子依赖性PS结合[4]。以上述知识为基础，我们利用Tim4固化磁珠，在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体，再添加螯合剂纯化外泌体。这种划时代的外泌体纯化方法是联合金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发，并取得了成功。[5]此外，MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS相比以前的外泌体纯化法，能更简捷地纯化高纯度且完整状态的外泌体。作为一种新型的外泌体纯化法，它可取代当前被认为是黄金标准的超速离心法。（图1）

PS Capture™ Exosome ELISA Kit的特点和使用案例

PS Capture™ Exosome ELISA Kit是Tim4蛋白通过PS和外泌体亲和性结合的应用ELISA试剂盒。本试剂盒将外泌体表面标记蛋白的抗体固相化，相比以前的ELISA法，可高灵敏度检测外泌体。此方法是将培养上清和血清等含有外泌体的样本添加到Tim4蛋白包被的干板，在钙离子存在下捕获外泌体，通过对外泌体表面标记蛋白质进行一抗结合反应和二抗结合反应，从而完成对外泌体检测（图2）。此外，本试剂盒附加了可作为一抗的小鼠抗CD63单抗，除此之外，若测定外泌体表面标记，需提前准备小鼠源一抗方可检测外泌体。

本试剂盒的最大特点就是实现了比免疫印迹和已有的Exosome ELISA产品更高灵敏度检测外泌体。首先，为了用本试剂盒和免疫印迹法比较检测灵敏度，在免疫印迹实验中需要检查外泌体检测极限值（图3a）。结果显示，以人结肠癌细胞的COLO201细胞源纯化外泌体作为样本通过抗CD63单抗进行免疫印迹实验，检测出蛋白质含量75ng的外泌体。然后，用本试剂盒检测纯化的白血病源细胞株K562细胞以及COLO201细胞源外泌体的ELISA检测极限值。K562细胞源外泌体的检测极限值为49.9pg，COLO201细胞源外泌体检测极限值为10.9pg。免疫印迹实验实际具有1000倍以上的检测灵敏度（图3b）。另外，已有Exosome ELISA产品的灵敏度在数ng~µg之间（参考各产品手册），但是本试剂盒通过PS与Tim4蛋白亲和性结合比原来外泌体表面标记抗体包被ELISA法在灵敏度上高出100倍以上。

最后，本试剂盒的使用案例为各种细胞源外泌体表面标记蛋白的表达分析。用13种细胞培养上清纯化的外泌体各1ng，通过外泌体标记蛋白CD9/CD63/CD81的抗体进行ELISA检测（图4）。结果显示，在各外泌体中表面标记蛋白的存在比例因来源细胞不同而存在明显差异。有的细胞株分泌不具有特定标记蛋白的外泌体，外泌体异质性高且明显的数据说明本试剂盒的ELISA系统是十分优质的。

结论

综上所述，利用Tim4蛋白的PS亲和性原理的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS实现了可简便高灵敏度地纯化外泌体。PS Capture™ Exosome ELISA Kit是高灵敏度检测外泌体的划时代产品。为此，通过使用本试剂盒对原方法混入杂质后外泌体标记蛋白确认分类问题和至今为止免疫印迹实验以及已有Exosome ELISA产品微量表面标记蛋白检测困难等问题都可解决。今后本公司将会利用Tim4蛋白的PS亲和性能开发外泌体研究相关试剂。真诚希望这些产品可以为外泌体研究发展做出贡献。

深入了解外泌体纯化和检测的新型工具

参考文献
[1] Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 （2016）.
[2] Raimondo, F. et al. : Proteomics,11, 709 （2011）.
[3] Trajkovic, K. et al. : Science,319 （5867）, 1244 （2008）.
[4] Miyanishi, M. et al. : Nature, 450, 435 （2007）.
[5] Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 （2016）.

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