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超分辨率显微镜,带你领略生物学更多奥秘[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年6月20日 来源:生物通

摘要:

  对于传统的光学显微镜,光的衍射让成像分辨率限制在大约250 nm。如今,超分辨率技术可以将此提高10倍以上。这种技术主要通过三种方法实现:单分子定位显微镜,包括光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM);结构照明显微镜(SIM);以及受激发射损耗显微镜(STED)。

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对于传统的光学显微镜,光的衍射让成像分辨率限制在大约250 nm。如今,超分辨率技术可以将此提高10倍以上。这种技术主要通过三种方法实现:单分子定位显微镜,包括光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM);结构照明显微镜(SIM);以及受激发射损耗显微镜(STED)。

如何选择超分辨率技术,这是大家都关心的。“不幸的是,并没有简单的原则来决定使用哪种方法,”英国牛津大学的博士后研究员Mathew Stracy说。“每一种都有其自身的优点和缺点。”

科学家当然也在想办法,为特定的项目选择合适的方法。以色列理工学院的助理教授Yoav Shechtman表示:“在生物成像的背景下,要考虑的关键因素包括:空间和时间分辨率、对光损伤的敏感性、标记能力、样本厚度,以及背景荧光或细胞自体荧光。”

工作原理

各种超分辨率显微镜是以不同的方式工作的。以PALM和STORM为例,在特定时刻,只有一小部分荧光标记激发或光活化,使得它们能够高精度地独立定位。让所有荧光标记都经历这个过程,这也就带来了一幅完整的超分辨率图像。2014年诺贝尔化学奖的获得者之一、马普生物物理化学研究所主任Stefan Hell表示:“PALM/STORM系统相对容易搭建,但比较难以应用,因为荧光基团必须具有光活化能力。局限之处在于它们需要检测细胞背景下的单个荧光分子,在可靠性上不及STED。”

STED使用激光脉冲来激发荧光基团,并使用环形的激光来淬灭荧光基团,只留下中间纳米大小的荧光而得到超高分辨率。扫描整个样本,可生成一幅图像。“STED的优势在于它是一种按钮技术,”Hell解释说。“它用起来就像标准的共聚焦荧光显微镜。”它还可以利用一些荧光基团对活细胞进行成像,比如绿色或黄色的荧光蛋白和罗丹明衍生染料。

参数对比

尽管所有超分辨率技术在分辨率上都超越了传统的光学显微镜,但彼此也各不相同。SIM大约将分辨率提高一倍,达到100 nm左右。PALM和STORM则可以分辨15 nm的目标。据Hell介绍,STED在活细胞中可提供30 nm的空间分辨率,在固定细胞中可达15 nm。

在涉及到特定应用时,我们还必须考虑信噪比。在有些情况下,分辨率较低但信噪比较高可能会比相反情况(分辨率较高但信噪比较低)带来更好的图像。

图像获取的速度也相当重要,特别是对于活细胞。“所有的超分辨率技术都比常规的荧光成像技术要慢,”Stracy说。“PALM/STORM是最慢的,需要成千上万帧来获得单幅图像,SIM需要几十帧,而STED是一种扫描技术,所以采集速度取决于视野的大小。”

除了活细胞或固定细胞成像,一些科学家也想了解对象如何移动。Stracy就很有兴趣了解活细胞中生物系统的动力学,而不仅仅是静态图像。他将PALM与单颗粒追踪相结合,来分析活细胞中的动力学。通过这种方式,他可以在标记分子行使功能时直接追踪它们。不过,他认为SIM并不适合研究这些分子水平的动态过程,但是由于获取速度快,它特别适合观察较大结构的动力学,如整条染色体。

最新成果

2017年,Hell的团队在《Science》上报道了MINFLUX超分辨率显微镜。据Hell介绍,这种超分辨率方法第一次达到1 nm的空间分辨率。此外,它还能追踪活细胞中的单个分子,速度比其他方法至少快100倍。

其他科学家也高度评价了MINFLUX显微镜。Shechtman说:“新的应用和方法在不断开发,但是有两个进步让我印象深刻。”一个就是MINFLUX。“它采用了一种巧妙的方法,来获得非常精准的分子定位。”

关于第二个让人兴奋的进展,Shechtman提到了W.E. Moerner及其斯坦福大学的同事,Moerner也是2014年诺贝尔化学奖的获奖者之一。为了解决荧光单分子的各向异性散射对成像分辨率的限制,这些科学家利用不同的激发极化来测定分子的方向以及位置。另外,他们还开发了精巧的光瞳面。这些技术改善了结构定位的能力。

聊聊标记

在许多超分辨率应用中,标记真的很重要。目前也有一些公司提供相关产品。例如,德国美天旎和Stefan Hell创办的公司Abberior合作,为超分辨率显微镜染料提供定制抗体结合服务。

其他的一些公司也提供与之相匹配的标记。ChromoTek的营销人员Christoph Eckert表示:“我们的Nano-Booster非常小,只有1.5 kDa,而且高度特异。”这些蛋白质可与绿色和红色荧光蛋白(GFP和RFP)相结合。它们来源于羊驼抗体片段,被称为VHH或纳米抗体,具有出色的结合性能,并且质量稳定,没有批间差。这些标记适合各种超分辨率技术,包括SIM、PALM、STORM和STED。

马里兰大学医学院的助理教授Ai-Hui Tang及其同事利用ChromoTek的GFP-Booster以及STORM,来探索神经系统中的信息传播。他们在突触前和突触后神经元中发现了分子纳米簇,将其称之为纳米柱(nanocolumn)。科学家认为,这种结构表明中枢神经系统采用简单的原理来维持和调节突触效率。
各种版本的超分辨率成像以及越来越多的方法正带领科学家更深入地领略生物学奥秘。在打破了可见光的衍射极限后,生物学家甚至可以“严密监视”细胞的行动。

(作者:Mike May / 生物通编译)

(http://www.ebiotrade.com/)
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