CRISPR/Cas9 三大新工具让基因编辑不再高冷[新品推荐]

与它的前任不同，CRISPR/Cas9系统让基因组编辑技术变得简单易行，又经济实惠。因此，原本高冷的基因组编辑技术迅速普及，进入更多的实验室。近年来，新的工具和产品不断涌现，为实验的每一环节提供了简便的方法。现在，我们就来盘点一下，CRISPR/Cas9领域有哪些新工具。

表达系统

在CRISPR/Cas9系统中，我们需要表达的是两个关键组分：Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA）。如今，尽管可供选择的表达系统在不断增加，但具体选择哪个，要取决于你的具体应用。大家可参考《新手指南：如何规划我的CRISPR实验》。

CRISPR质粒是大家比较青睐的方法。许多公司目前提供all-in-one的表达载体，包括Cas9核酸酶表达框以及gRNA克隆框，能够快速高效地表达Cas9和gRNA。这些载体往往还带有报告基因或选择标记，以便富集阳性细胞。

赛默飞世尔就提供了两种GeneArt CRISPR Nuclease Vector，一种带有橙色荧光蛋白（OFP），可通过流式细胞仪分选表达gRNA的细胞；另一种则带有CD4报告基团，便于通过Dynabeads CD4磁珠富集阳性细胞。

Takara旗下的Clontech也提供了各种质粒载体系统，包括Guide-it™ CRISPR/Cas9 System。这种单质粒系统实现了Cas9与绿色/红色荧光蛋白（ZsGreen1或tdTomato）标记的同时表达，便于监测转染效率，让细胞富集/分选变得更简单。若细胞难以转染，则可以考虑重组腺相关病毒介导的基因编辑系统。

AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System是一个一体化系统，包括了制备AAV病毒所需的全部组分。AAV的不整合特性避免了Cas9的持续表达，减少了细胞毒性和脱靶效应，也适合体内应用。

对于转染效率低的细胞，Clontech还推出了一个新的解决方案，那就是借助细胞来源的纳米囊泡（Gesicle）。Gesicle表面附有具有细胞膜亲和特性的NIGP蛋白质，使其可以与广泛的细胞类型相融合。你只要将Cas9和gRNA包被其中，就可以高效导入。Gesicle表面同样也附有CherryPicker红色荧光蛋白，便于通过荧光显微镜进行监测。

CRISPR系统的脱靶效应也是让人关心/担心的。若希望尽量减少脱靶切割，可以考虑Invitrogen™ GeneArt Platinum Cas9 Nuclease。这是一种野生型的Cas9蛋白，它与gRNA形成非常稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物，能够实现高效的切割。这种复合物在进入细胞后立即发挥作用，而不需要转录和翻译，带来立竿见影的效果。同时，它会被细胞迅速清除，与载体相比造成脱靶切割的机会降低。Cas9 RNP复合物可以通过赛默飞专利的Lipofectamine CRISPRMAX转染试剂导入细胞，也可通过显微注射。

设计gRNA

关于gRNA的设计，许多网站都提供了设计工具，而许多科学家也贡献了宝贵经验。在不同的CRISPR实验中，设计gRNA时的考虑因素也不同。对于插入缺失的应用，gRNA靶定的位置并不重要，但必须活性高，脱靶效应低。对于基因表达的激活或抑制，位置和序列都必须考虑。而对于基因编辑（如HDR），位置是重要的考虑因素，因为靶定位置必须在编辑区域附近，这也意味着没有太多gRNA可供选择。

（图片来自Addgene）

在挑选了若干条gRNA之后，如果你需要制备gRNA。NEB有一个十分受欢迎的工具 – EnGen sgRNA Synthesis Kit，可在一小时内产生和纯化5-20 μg gRNA。你只需要一条短短的单链DNA oligo就行了，无需PCR、无需克隆，也不需要等待RNA oligo的化学合成。它将试剂盒自带的Cas9特异的Scaffold Oligo与你的DNA oligo退火，然后用DNA聚合酶延伸，形成双链DNA模板并转录，从而产生功能性的gRNA。

Addgene这个质粒共享的非营利组织，也提供了2000多种经过验证的gRNA，是全球科学家在实验中使用过的。此外，Addgene也提供全基因组水平的gRNA文库，以及适合各种实验的空骨架，以便研究人员能克隆特定基因的gRNA。据介绍，最受欢迎的质粒是空的gRNA载体PX458和PX459，它们来自张锋实验室，包含SpCas9和选择标记EGFP或PuroR。

确认结果

在一系列克隆、转染、表达的工作完成后，最紧张的时刻来了，你需要确认基因编辑的效果。《新手指南：如何规划我的CRISPR实验》这里介绍了一些方法。市场上也有一些成熟的产品，可简化你的工作。

Clontech的Guide-it™系列就包括多个产品，可检测基因编辑的效率、确认细胞基因型，以及鉴定突变位点的序列。Guide-it™ Mutation Detection Kit利用错配裂解法快速检出细胞基因组中导入的插入缺失突变。它无需提取DNA，可直接以细胞为起点进行PCR扩增。将PCR产物变性和退火之后，Guide-it™解离酶对不完全匹配的DNA进行剪切。之后跑胶，可根据片段大小确认编辑效果。

有时，你是不是也有这样的困扰，花了大量的时间和成本，却很难筛选到双等位基因突变型克隆。Guide-it™ Genotype Confirmation Kit此时可以帮你解忧。它通过Cas9和gRNA体外剪切，可方便地确认单等位基因和双等位基因突变。在目的片段扩增后，Cas9和gRNA剪切野生型、单等位基因突变和双等位基因突变的片段，可以产生不同大小的片段，从而轻松地区分。

如今，有了这些新工具，CRISPR/Cas9基因编辑可谓触手可及。不过，基因编辑技术日新月异，稍不留神，就会错过最新进展。希望紧跟技术潮流，那就赶紧关注生物通吧。（生物通 余亮）

了解Clontech的CRISPR/Cas9基因组编辑完整解决方案