让我们来谈谈困难样本的NGS文库制备[选购宝典]

如今，许多实验室中都可以看到高通量测序仪的身影。随着测序成本的下降，新一代测序（NGS）不再是一种高冷的技术。然而，面对一些难以对付的样本，比如核酸量有限的、高度降解的或富含抑制剂的，过去人们只能摊摊手，表示无能为力。

当然，科研人员的智慧是无穷的，这些问题可难不倒他们。有了高度灵敏的质量控制措施和经过优化的核酸纯化技术，那些年代久远、高度降解或饱经污染的样本现在也能成功测序了。

质量控制

让我们先来谈谈质量控制（QC）吧。由于样本采集和保存过程存在差异，质量控制已成为NGS样本制备时最重要的步骤之一。了解样本的降解程度或化学修饰，可以帮助我们确定在样本制备时要走哪条路。

利用安捷伦的2100 Bioanalyzer或4200 TapeStation这些质量控制工具，我们可获取核酸定量、完整性和片段大小等信息，让测序过程有个良好的开端。这两个系统都被广泛认可，应用在各种NGS流程中。同时，利用260/280比值来分析核酸纯度，可以了解样本中是否有抑制下游反应的污染物。

降解程度也是一个重要指标，说明样本能否被测序。Illumina建议使用他们的TruSeq FFPE DNA Library Prep QC Kit来评估样本质量。这个试剂盒利用定量PCR检测来评估DNA样本的质量，以确定它们是否可用，避免不必要的时间和资源浪费。对于RNA，建议使用DV200指数来确定FFPE RNA的量。

Tips：DV200指标由Illumina科学家开发，指的是> 200 nt的RNA片段的百分比。与传统的RIN数值相比，DV200值所代表的RNA片段平均大小可以更可靠地反映FFPE样本中RNA的质量。DV200值与RNA成功测序之间存在着直接的关联。

FFPE样本

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本作为宝贵的组织材料，蕴藏着丰富的信息。随着癌症研究、罕见病研究及其他应用的开展，人们对FFPE样本的兴趣在逐步增加。许多公司也不断开发出解决方案，试图从这些富有挑战性的样本中获得详细的数据。

FFPE样本的挑战就在于提取出的核酸质量不高。因样本采集和固定、样本保存，以及核酸提取过程中的种种原因，FFPE样本可能会经历脱氨、交联或降解。此外，每一块FFPE组织都是独特的。肿瘤内容、肿瘤分期、组织类型都可能对核酸分离产生影响。

Illumina的TruSeq Custom Amplicon Low Input kit就是专门为低起始量和FFPE样本而设计的。这个试剂盒基于Illumina的扩增子技术，可从低至10 ng的基因组DNA和FFPE样本中准确检测出变异。它利用双探针设计来生成数据，避免因脱氨事件而引起的任何假阳性。

至于RNA测序，捕获编码转录组的传统方法是基于poly-A，但是在处理降解或FFPE样品时效果不佳。Illumina的TruSeq RNA Access Library Prep Kit则克服了这一限制，不依赖于poly-A转录本的存在，而是采用序列特异的捕获。它为RNA测序带来了一个经济实惠的解决方案，而且还适用于自动化系统。

说到自动化系统，不得不提Beckman Coulter的Biomek液体处理平台。它可以自动化处理多家公司的NGS文库制备试剂盒，生成可立即测序的文库，包括NEB的NEBNext Ultra II DNA Kit和Kapa Biosystems的Kapa HyperPlus Kit。此外，它家的FormaPure核酸提取试剂盒基于 Agencourt SPRI 技术，能从FFPE样本中提取出高质量、高产量的DNA。

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宝贵体液

因液体活检的大热，研究人员开始采集血液样本，对其中的循环游离DNA（ccfDNA）进行测序，以了解疾病进程并指导治疗。然而，这些样本可能存在污染物或抑制剂，为样本制备带来不小的挑战。

为了确保预分析步骤不影响下游的分析，QIAGEN专门推出了PAXgene Blood ccfDNA采血管。与传统的EDTA抗凝管相比，这种采血管采集的全血可在室温下放置7天，从而方便样本的运输。它采用了一种非交联反应的稳定剂，可有效防止溶血及gDNA的释放，最大限度减少对ccfDNA的改变。

对于ccfDNA的纯化，QIAGEN也提供了多种产品。新的QIAamp MinElute ccfDNA kit就可以高效地从血清和血浆样本中纯化出ccfDNA。它通过磁珠来预先浓缩循环核酸，然后通过方便快速的离心步骤来纯化核酸。整个过程相当轻松，特别适合多个样本的同时处理。洗脱体积低至20 µl，在去除污染物和抑制剂的同时可带来高浓度的核酸。

QIAseq cfDNA All-in-One Kit则率先将ccfDNA提取与文库制备相结合，以满足外显子组或全基因组测序的需求。这个过程包括两个主要步骤：从血浆中提取ccfDNA，以及NGS的文库制备。核酸提取也是采取经典的过柱法。由于ccfDNA通常约为170 bp，故文库制备之前不需要片段化。洗脱液可直接用于文库制备。

之后对ccfDNA的末端进行适当处理，并连上测序接头和条形码，这样多个样品即可在单次运行中同时测序。酶的配方和缓冲液已针对ccfDNA进行优化，因此只要有10 ng ccfDNA，就能够生成NGS文库，而无需PCR扩增。All-in-One Kit有两个版本，分别适用于Illumina和Ion Torrent的测序仪。

了解QIAGEN为循环游离DNA（ccfDNA）提供的一体化方案

样本太少

样本量少，意味着数据量也少。不过，单细胞分析可是目前的大势所趋啊。为了应对这一挑战，GE等公司推出了专门的试剂盒。Single Cell GenomiPhi kit采用独特配方和 Phi29 DNA聚合酶，能够可靠扩增单细胞中的基因组DNA，用于NGS文库构建。

全基因组扩增的过程大约需要2-4小时，可产生4-7 µg的基因组DNA。整个基因组的扩增是高度均匀的，因此，各个位点的代表性仍然非常接近原始的DNA样本。此外，Phi29 DNA聚合酶具有校对活性，可保证扩增的高保真性。这样，来自单细胞的DNA经过重复可靠地扩增，可以作为基因分型或新一代测序的模板。

New England BioLabs在这方面也有不少产品，包括全新升级的NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit和NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit，能够利用更低的起始量和更少的循环数制备出高质量的文库。

文库制备过程中每个步骤的试剂都经过优化，只需要提供500 pg–1 μg的起始DNA、10 ng–1 μg总RNA或10 ng–100 ng纯化的mRNA或去除了rRNA的RNA，即可制备出文库。NEBNext Ultra II的流程融合了末端修复和dA加尾的步骤，最大限度减少了纯化工作，让整个操作更加快速方便。实际上，构建DNA文库只需要10分钟的手动操作，整个过程可在2个半小时内完成。

结语

尽管样本制备的新技术在不断涌现，但样本采集、核酸分离以及文库制备的整个过程仍然缺乏标准化，这有可能带来不可靠甚至错误的分析结果。为此，CANCER-ID联盟宣布成立。这是一个公私联合的欧洲联盟，致力于为基于血液的癌症生物标志物建立标准方案和临床验证。它汇集了13个国家的36个合作伙伴，为液体活检的临床应用铺平道路。

此外，不知大家是否有同感，NGS文库制备的试剂盒实在是“乱花渐欲迷人眼”。针对不同的起始材料、不同的起始量、不同的应用，各家公司都有多款产品奉上。不光买东西的人困恼，做实验的人更是困扰，一不留神就搞错了。因此，许多公司，比如NEB，正在开发那种广泛适用的试剂盒，希望用少量的产品来满足广泛的需求。如果能够成功，那可真让人们松一口气。（生物通 余亮）