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让我们来谈谈困难样本的NGS文库制备[选购宝典]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年8月11日 来源:生物通

摘要:

  面对一些难以对付的样本,比如核酸量有限的、高度降解的或富含抑制剂的,过去人们只能摊摊手,表示无能为力。当然,科研人员的智慧是无穷的,这些问题可难不倒他们。

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如今,许多实验室中都可以看到高通量测序仪的身影。随着测序成本的下降,新一代测序(NGS)不再是一种高冷的技术。然而,面对一些难以对付的样本,比如核酸量有限的、高度降解的或富含抑制剂的,过去人们只能摊摊手,表示无能为力。

当然,科研人员的智慧是无穷的,这些问题可难不倒他们。有了高度灵敏的质量控制措施和经过优化的核酸纯化技术,那些年代久远、高度降解或饱经污染的样本现在也能成功测序了。

质量控制

让我们先来谈谈质量控制(QC)吧。由于样本采集和保存过程存在差异,质量控制已成为NGS样本制备时最重要的步骤之一。了解样本的降解程度或化学修饰,可以帮助我们确定在样本制备时要走哪条路。

利用安捷伦的2100 Bioanalyzer或4200 TapeStation这些质量控制工具,我们可获取核酸定量、完整性和片段大小等信息,让测序过程有个良好的开端。这两个系统都被广泛认可,应用在各种NGS流程中。同时,利用260/280比值来分析核酸纯度,可以了解样本中是否有抑制下游反应的污染物。

降解程度也是一个重要指标,说明样本能否被测序。Illumina建议使用他们的TruSeq FFPE DNA Library Prep QC Kit来评估样本质量。这个试剂盒利用定量PCR检测来评估DNA样本的质量,以确定它们是否可用,避免不必要的时间和资源浪费。对于RNA,建议使用DV200指数来确定FFPE RNA的量。

Tips:DV200指标由Illumina科学家开发,指的是> 200 nt的RNA片段的百分比。与传统的RIN数值相比,DV200值所代表的RNA片段平均大小可以更可靠地反映FFPE样本中RNA的质量。DV200值与RNA成功测序之间存在着直接的关联。

FFPE样本

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本作为宝贵的组织材料,蕴藏着丰富的信息。随着癌症研究、罕见病研究及其他应用的开展,人们对FFPE样本的兴趣在逐步增加。许多公司也不断开发出解决方案,试图从这些富有挑战性的样本中获得详细的数据。

FFPE样本的挑战就在于提取出的核酸质量不高。因样本采集和固定、样本保存,以及核酸提取过程中的种种原因,FFPE样本可能会经历脱氨、交联或降解。此外,每一块FFPE组织都是独特的。肿瘤内容、肿瘤分期、组织类型都可能对核酸分离产生影响。

Illumina的TruSeq Custom Amplicon Low Input kit就是专门为低起始量和FFPE样本而设计的。这个试剂盒基于Illumina的扩增子技术,可从低至10 ng的基因组DNA和FFPE样本中准确检测出变异。它利用双探针设计来生成数据,避免因脱氨事件而引起的任何假阳性。

至于RNA测序,捕获编码转录组的传统方法是基于poly-A,但是在处理降解或FFPE样品时效果不佳。Illumina的TruSeq RNA Access Library Prep Kit则克服了这一限制,不依赖于poly-A转录本的存在,而是采用序列特异的捕获。它为RNA测序带来了一个经济实惠的解决方案,而且还适用于自动化系统。

说到自动化系统,不得不提Beckman Coulter的Biomek液体处理平台。它可以自动化处理多家公司的NGS文库制备试剂盒,生成可立即测序的文库,包括NEB的NEBNext Ultra II DNA Kit和Kapa Biosystems的Kapa HyperPlus Kit。此外,它家的FormaPure核酸提取试剂盒基于 Agencourt SPRI 技术,能从FFPE样本中提取出高质量、高产量的DNA。

欢迎索取Illumina的NGS文库制备产品选择指南

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