让我们来谈谈困难样本的NGS文库制备[选购宝典]

【字体: 时间:2017年08月11日 来源:生物通

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  面对一些难以对付的样本,比如核酸量有限的、高度降解的或富含抑制剂的,过去人们只能摊摊手,表示无能为力。当然,科研人员的智慧是无穷的,这些问题可难不倒他们。

如今,许多实验室中都可以看到高通量测序仪的身影。随着测序成本的下降,新一代测序(NGS)不再是一种高冷的技术。然而,面对一些难以对付的样本,比如核酸量有限的、高度降解的或富含抑制剂的,过去人们只能摊摊手,表示无能为力。

当然,科研人员的智慧是无穷的,这些问题可难不倒他们。有了高度灵敏的质量控制措施和经过优化的核酸纯化技术,那些年代久远、高度降解或饱经污染的样本现在也能成功测序了。

质量控制

让我们先来谈谈质量控制(QC)吧。由于样本采集和保存过程存在差异,质量控制已成为NGS样本制备时最重要的步骤之一。了解样本的降解程度或化学修饰,可以帮助我们确定在样本制备时要走哪条路。

利用安捷伦的2100 Bioanalyzer或4200 TapeStation这些质量控制工具,我们可获取核酸定量、完整性和片段大小等信息,让测序过程有个良好的开端。这两个系统都被广泛认可,应用在各种NGS流程中。同时,利用260/280比值来分析核酸纯度,可以了解样本中是否有抑制下游反应的污染物。

降解程度也是一个重要指标,说明样本能否被测序。Illumina建议使用他们的TruSeq FFPE DNA Library Prep QC Kit来评估样本质量。这个试剂盒利用定量PCR检测来评估DNA样本的质量,以确定它们是否可用,避免不必要的时间和资源浪费。对于RNA,建议使用DV200指数来确定FFPE RNA的量。

Tips:DV200指标由Illumina科学家开发,指的是> 200 nt的RNA片段的百分比。与传统的RIN数值相比,DV200值所代表的RNA片段平均大小可以更可靠地反映FFPE样本中RNA的质量。DV200值与RNA成功测序之间存在着直接的关联。

FFPE样本

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本作为宝贵的组织材料,蕴藏着丰富的信息。随着癌症研究、罕见病研究及其他应用的开展,人们对FFPE样本的兴趣在逐步增加。许多公司也不断开发出解决方案,试图从这些富有挑战性的样本中获得详细的数据。

FFPE样本的挑战就在于提取出的核酸质量不高。因样本采集和固定、样本保存,以及核酸提取过程中的种种原因,FFPE样本可能会经历脱氨、交联或降解。此外,每一块FFPE组织都是独特的。肿瘤内容、肿瘤分期、组织类型都可能对核酸分离产生影响。

Illumina的TruSeq Custom Amplicon Low Input kit就是专门为低起始量和FFPE样本而设计的。这个试剂盒基于Illumina的扩增子技术,可从低至10 ng的基因组DNA和FFPE样本中准确检测出变异。它利用双探针设计来生成数据,避免因脱氨事件而引起的任何假阳性。

至于RNA测序,捕获编码转录组的传统方法是基于poly-A,但是在处理降解或FFPE样品时效果不佳。Illumina的TruSeq RNA Access Library Prep Kit则克服了这一限制,不依赖于poly-A转录本的存在,而是采用序列特异的捕获。它为RNA测序带来了一个经济实惠的解决方案,而且还适用于自动化系统。

说到自动化系统,不得不提Beckman Coulter的Biomek液体处理平台。它可以自动化处理多家公司的NGS文库制备试剂盒,生成可立即测序的文库,包括NEB的NEBNext Ultra II DNA Kit和Kapa Biosystems的Kapa HyperPlus Kit。此外,它家的FormaPure核酸提取试剂盒基于 Agencourt SPRI 技术,能从FFPE样本中提取出高质量、高产量的DNA。

欢迎索取Illumina的NGS文库制备产品选择指南


宝贵体液

因液体活检的大热,研究人员开始采集血液样本,对其中的循环游离DNA(ccfDNA)进行测序,以了解疾病进程并指导治疗。然而,这些样本可能存在污染物或抑制剂,为样本制备带来不小的挑战。

为了确保预分析步骤不影响下游的分析,QIAGEN专门推出了PAXgene Blood ccfDNA采血管。与传统的EDTA抗凝管相比,这种采血管采集的全血可在室温下放置7天,从而方便样本的运输。它采用了一种非交联反应的稳定剂,可有效防止溶血及gDNA的释放,最大限度减少对ccfDNA的改变。

对于ccfDNA的纯化,QIAGEN也提供了多种产品。新的QIAamp MinElute ccfDNA kit就可以高效地从血清和血浆样本中纯化出ccfDNA。它通过磁珠来预先浓缩循环核酸,然后通过方便快速的离心步骤来纯化核酸。整个过程相当轻松,特别适合多个样本的同时处理。洗脱体积低至20 µl,在去除污染物和抑制剂的同时可带来高浓度的核酸。

QIAseq cfDNA All-in-One Kit则率先将ccfDNA提取与文库制备相结合,以满足外显子组或全基因组测序的需求。这个过程包括两个主要步骤:从血浆中提取ccfDNA,以及NGS的文库制备。核酸提取也是采取经典的过柱法。由于ccfDNA通常约为170 bp,故文库制备之前不需要片段化。洗脱液可直接用于文库制备。

之后对ccfDNA的末端进行适当处理,并连上测序接头和条形码,这样多个样品即可在单次运行中同时测序。酶的配方和缓冲液已针对ccfDNA进行优化,因此只要有10 ng ccfDNA,就能够生成NGS文库,而无需PCR扩增。All-in-One Kit有两个版本,分别适用于Illumina和Ion Torrent的测序仪。

了解QIAGEN为循环游离DNA(ccfDNA)提供的一体化方案

样本太少

样本量少,意味着数据量也少。不过,单细胞分析可是目前的大势所趋啊。为了应对这一挑战,GE等公司推出了专门的试剂盒。Single Cell GenomiPhi kit采用独特配方和 Phi29 DNA聚合酶,能够可靠扩增单细胞中的基因组DNA,用于NGS文库构建。

全基因组扩增的过程大约需要2-4小时,可产生4-7 µg的基因组DNA。整个基因组的扩增是高度均匀的,因此,各个位点的代表性仍然非常接近原始的DNA样本。此外,Phi29 DNA聚合酶具有校对活性,可保证扩增的高保真性。这样,来自单细胞的DNA经过重复可靠地扩增,可以作为基因分型或新一代测序的模板。

New England BioLabs在这方面也有不少产品,包括全新升级的NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit和NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit,能够利用更低的起始量和更少的循环数制备出高质量的文库。

文库制备过程中每个步骤的试剂都经过优化,只需要提供500 pg–1 μg的起始DNA、10 ng–1 μg总RNA或10 ng–100 ng纯化的mRNA或去除了rRNA的RNA,即可制备出文库。NEBNext Ultra II的流程融合了末端修复和dA加尾的步骤,最大限度减少了纯化工作,让整个操作更加快速方便。实际上,构建DNA文库只需要10分钟的手动操作,整个过程可在2个半小时内完成。

结语

尽管样本制备的新技术在不断涌现,但样本采集、核酸分离以及文库制备的整个过程仍然缺乏标准化,这有可能带来不可靠甚至错误的分析结果。为此,CANCER-ID联盟宣布成立。这是一个公私联合的欧洲联盟,致力于为基于血液的癌症生物标志物建立标准方案和临床验证。它汇集了13个国家的36个合作伙伴,为液体活检的临床应用铺平道路。

此外,不知大家是否有同感,NGS文库制备的试剂盒实在是“乱花渐欲迷人眼”。针对不同的起始材料、不同的起始量、不同的应用,各家公司都有多款产品奉上。不光买东西的人困恼,做实验的人更是困扰,一不留神就搞错了。因此,许多公司,比如NEB,正在开发那种广泛适用的试剂盒,希望用少量的产品来满足广泛的需求。如果能够成功,那可真让人们松一口气。(生物通 余亮)

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