跟着文献做实验：如何应对ccfDNA的采集难题

一直以来，科学家们都在苦苦寻找非侵入性的癌症标志物。他们希望通过有效且无创或微创的方式来实现癌症的检测、监控和治疗。传统的活检是侵入性的，存在风险，有时甚至很难做到。幸运的是，他们发现，肿瘤细胞可将DNA释放到血液中，这就是循环游离DNA（ccfDNA）。与从FFPE肿瘤标本中采集的静态DNA相比，ccfDNA可提供原发和转移性肿瘤的实时突变信息。这将大大改善治疗决策和监控，对癌症及其他疾病的生物标志物的检测和监控具有重要的意义。

目前的大型研究通常需要从不同的临床环境采集大量患者的样本。人们一般采用EDTA抗凝管来储存血液，然而，这种做法的缺点是血液必须在短时间内进行处理，否则将会发生溶血反应，特别是白细胞等释放出高分子量的基因组DNA，而同时真正意义上的ccfDNA却在不断降解。

为了解决这些问题，一些公司开发出含有稳定剂的采血管，可以防止细胞裂解及释放基因组DNA。比如，Streck推出了Cell-Free DNA BCT管，而我们熟悉的QIAGEN也推出了PAXgene Blood ccfDNA管。它们的性能究竟如何？一些研究给出了测评报告。

稳定性能大比拼

澳大利亚新南威尔士大学的研究人员近日评估了Streck BCT管、PAXgene ccfDNA管以及标准的EDTA采血管在DNA产量和片段大小上的表现¹。他们利用EDTA、Streck BCT或PAXgene ccfDNA管来储存血液，并在4°C放置1小时，或在室温下放置4天。之后提取出DNA，通过凝胶电泳来观察或利用qPCR来定量。

研究人员发现，在室温下储存4天后，EDTA管中样本的血浆DNA增加了10-20倍，而Streck BCT管或PAXgene ccfDNA管都保持了稳定的血浆DNA浓度。不过，通过凝胶电泳，他们也观察到Streck BCT管中的高分子量DNA略有增加，提示可能依然存在一定程度的基因组DNA污染。而同时，相对应的实验结果也表明，从PAXgene ccfDNA采集稳定的全血样本中分离的白膜层细胞依然可以同时用于完整性、浓度很好的基因组DNA提取。

早些时候，德国柏林的研究人员也比较了EDTA管和PAXgene Blood ccfDNA管的表现²。他们招募了29名患者，将血液样本分别放入EDTA管和PAXgene Blood ccfDNA管中，在抽血后2-3小时后处理，或在室温下储存7天后处理。研究表明，对于几乎所有的EDTA管，7天室温储存导致DNA总量的显著增加，但这种现象在PAXgene Blood ccfDNA管中极少见到。同时，PAXgene ccfDNA管中的非交联稳定剂使得对于样本中甲基化序列的定量并没有产生影响，可成功用于PCR定量和甲基化分析。

作者的结论是，若在抽血几小时后处理，PAXgene Blood ccfDNA管的表现与EDTA管相当。分离出的游离核酸在数量和质量上不相上下，且在下游应用中无差别。不过，若在室温下储存多日，EDTA管中的细胞外DNA明显增加，而PAXgene Blood ccfDNA管则起到了很好的稳定作用。事实上，作者在文中也提到了Streck BCT管。不过，考虑到Streck BCT管在预实验结果中并不支持甲基化序列的分析，因此这次分析未包括Streck BCT管。好在，从PAXgene Blood ccfDNA管中获得的ccfDNA可以与甲基化检测完全兼容，比如那些需要用亚硫酸氢盐处理的检测。

ccfDNA分离：手动 vs. 自动

PAXgene Blood ccfDNA管来自QIAGEN和BD的合资公司PreAnalytiX，自然也传承了两家公司的出色品质。它的材质是特殊处理的高硬度透明塑料，可对抗运输过程中的撞击并支持高速离心。采血管采用了一种非交联反应的稳定剂，可有效防止溶血及gDNA的释放，特别是防止对ccfDNA的交联反应修饰。采集后的全血可在室温下放置10天。

当然，血液采集只是手段，分离出高质量的游离核酸才是目的。对于后续的核酸分离，你可以选择亲自动手，也可以交给仪器去完成。十分经典的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit利用柱膜法从血浆样本中提取高效提取来自多种不同样本中的游离核酸。而对于自动化分离，可以选择QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit，配合PAXgene Blood ccfDNA Tube在QIAsymphony系统上完成大体积样本的ccfDNA高通量完全自动化提取。

至于这两者的效果如何，德国柏林的研究人员也对比了一下。他们手动分离了10个血浆样本的ccfDNA，而另外19名患者的DNA分离则是由QIAsymphony系统自动完成的。他们发现，分离操作对ccfDNA的产量和质量同之前的经典手工方法效果相当。同时，该套系统还可以支持PAXgene Blood ccfDNA Tube的直接上样，无需将在原管中离心后的血浆进行转管操作，极大降低了提取实验的前处理过程，真正实现样本采集、稳定及提取的无缝连接。

有了提取得到的ccfDNA，接下来还可以继续使用专为ccfDNA而开发的QIAseq cfDNA Library Kit进行快速简便的NGS文库构建，用在Illumina或Ion Torrent平台。相关实验数据表明，该方法可显著提高ccfDNA的文库转化效率及覆盖均一性，并降低测序结果中接头二聚体的污染，极大提高ccfDNA的测序效率。有兴趣的读者欢迎索取QIAGEN ccfDNA完整解决方案的详细资料。

 
参考文献

1. Warton K, Yuwono NL, Cowley MJ, McCabe MJ, So A, Ford CE. Evaluation of Streck BCT and PAXgene Stabilised Blood Collection Tubes for Cell-Free Circulating DNA Studies in Plasma. Mol Diagn Ther. 2017 Jun 19. doi: 10.1007/s40291-017-0284-x.

2. Schmidt B, Reinicke D, Reindl I, Bork I, Wollschläger B, Lambrecht N, Fleischhacker M. Liquid biopsy - Performance of the PAXgene® Blood ccfDNA Tubes for the isolation and characterization of cell-free plasma DNA from tumor patients. Clin Chim Acta. 2017 Jun;469:94-98. doi: 10.1016/j.cca.2017.03.031.

（生物通 余亮）