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单细胞研究的前哨:单细胞分离

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年9月1日 来源:生物通

摘要:

  在此,我们将回顾单细胞RNA测序技术的发展。不过,我们首先要聊聊单细胞分离,这似乎是单细胞研究中最困难的一步。

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人体中究竟有多少种类型的细胞?现阶段我们恐怕无法给出一个确切的答案。多细胞生物的每个细胞都携带着相同的遗传学信息,不过,它们又是独一无二的。不同类型的细胞采用特定的基因组合来产生蛋白质。

那么,检测细胞内的RNA分子也许能提供一些线索。基于这个原因,单细胞RNA测序技术在近年来发展迅速,带来了许多让人眼前一亮的新成果。人类细胞图谱(Human Cell Atlas)计划也在去年启动,被MIT Technology Review评为十大突破技术之一。

在此,我们将回顾单细胞RNA测序技术的发展。不过,我们首先要聊聊单细胞分离,这似乎是单细胞研究中最困难的一步。

单细胞的分离

从异质性的细胞群体中分离单细胞,目前主要有三种选择:手动分离、荧光激活细胞分选和微流体技术。当然,除了成熟的方法,巧妙的新方法也在不断涌现,能以更高的准确性和特异性来分离单细胞。

如果你想要的细胞已经处于悬浮状态(比如循环肿瘤细胞),而且含量相对比较丰富,那么流式分选将是你的理想选择。如果样本是实体组织,我们可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过,酶学消化对细胞影响较大,甚至可能改变基因转录情况。把组织细胞制备成悬液之后,我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞。进一步拿到单细胞是比较棘手的一步,也许要借助微流体设备。

将细胞分散到悬液中,会失去它们在组织里的位置信息。如果你想了解单细胞所处的环境和它们以前的邻居,就需要用到激光捕获显微切割技术。这种技术通过扫描组织切片来定位感兴趣的细胞,并将其提取出来。操作者需要非常小心,以免切到细胞或细胞核。数量极为稀少的细胞只能用毛细管等器具手动获取。

此外,一种称为体内转录组分析(TIVA)的方法也被开发出,可以利用TIVA标记在光激活情况下捕获来自活体组织单个细胞中的mRNA,助力转录组研究的开展。

各种技术的优缺点

荧光激活细胞分选(FACS)

样本类型:解离的细胞悬液
 
优点:
1. 细胞表面标志物的特异标记
2. 多个同时存在的标记可确保特定细胞的分离
3. 可将细胞分选至96孔或384孔板,纯度接近100%
缺点:
1. 需要特异针对细胞表面标志物的抗体
2. 无法扩展到大规模项目
3. 通量低,需要大的起始量
4. 回收的细胞受到机械应力
5. 在分选前需要优化

微流体

样本类型:解离的细胞悬液 

优点:
1. 能够从少量样本中分离无法培养的细胞
2. 可根据细胞表面标志物分离特定细胞
3. 稀有的循环肿瘤细胞已被成功分离
缺点:
1. 成本高

显微操作

样本类型:解离的细胞悬液

优点:
1. 从不同的发育阶段分离单个细胞,如神经元
2. 从多样化的群体中分离细胞 
缺点:
1. 通量低,需要大的起始量
2. 细胞特异性由显微镜决定,并利用微量移液管分离,可能不够准确

光学镊子

样本类型:解离的细胞悬液

优点:
1. 与微量移液管相比,细胞分离更加集中可控
2. 自动分选单个细胞
3. 通量高
4. 感兴趣细胞的荧光标记 
缺点:
1. 因安装门槛高,只有少数实验室可采用

激光捕获显微切割(LCM)

样本类型:组织样本

优点:
1. 在天然环境下从完整组织中分离细胞,保留所分离细胞的RNA完整性
2. 从感兴趣的组织中快速分离单细胞
3. 可与显微镜技术结合,了解组织中单细胞时间转录组学
4. 无需解离组织,制备细胞悬液 
缺点:
1. 组织必须是冷冻保存或固定的
2. 显微切割可能存在挑战
3. 小的细胞可能难以分离
4. 需要适当的组织处理,以维持完整性
5. 在细胞分离和组织切割时,可能存在RNA污染

体内转录组分析(TIVA)

样本类型:组织样本

优点:
1. 研究活细胞中单个细胞的时间转录组学
2. 直接捕获单个细胞中的mRNA,保留细胞对微环境的反应
3. 非侵入性操作 
缺点:
1. 通量低
2. 每次研究一种组织

(http://www.ebiotrade.com/)
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