用户名:

密 码:

测序 | miRNA | 表观遗传 | 蛋白研究 | 细胞研究 | 免疫学 | 转染 | PCR | qPCR | 核酸纯化 | 基因表达

您所在的位置:首页 > 新技术专栏

高成功率的SMARTer RACE一站式解决方案

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年8月10日 来源:Takara

摘要:

  SMARTer RACE方法巧妙地利用SMARTer技术,即Switching Mechanism At the end of RNA Template,模板末端的转换机制,在一个反应内就可以完成带有接头序列的第一链cDNA合成,后续只需进行PCR就可高成功率地获得目的RACE片段。

分享到:
  

对RNA结构进行分析时,一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域,然后再对DNA 片段进行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反应很难得到全长的cDNA片段,然而在基因工程研究中分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要的。

Clontech专利SMARTer技术为轻松简便地合成高质量全长cDNA提供了可能。

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)即cDNA末端的快速扩增,传统的RACE方法应用“去帽法”原理:对Total RNA裸露的5‘磷酸基团进行去磷酸化,使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’帽子结构,使用T4 RNA Ligase将5’RACE Adaptor连接到mRNA的5’端,反转录反应扩增cDNA,使用5’RACE Adaptor上的引物与已知序列部分的引物进行PCR反应,扩增cDNA 5’末端的序列。

传统的“去帽法”RACE有这样几个局限性:要求RNA起始量比较大,多个对RNA的处理、纯化步骤易导致RNA降解,实验步骤较多导致实验成功率较低等等。

SMARTer RACE方法就能够解决传统方法的这些问题。SMARTer RACE方法巧妙地利用SMARTer技术,即Switching Mechanism At the end of RNA Template,模板末端的转换机制,在一个反应内就可以完成带有接头序列的第一链cDNA合成,后续只需进行PCR就可高成功率地获得目的RACE片段。

SMARTer技术原理如下:

SMARTer技术的核心组分包括SMARTScribe逆转录酶和SMARTer Oligo序列。SMARTScribe逆转录酶具有灵敏度高和延伸性能好的特点。根据我们的实验数据,SMARTScribe 逆转录酶可以以低至10个拷贝的RNA为模板合成第一链cDNA;可获得长达14.6 kb的cDNA片段。

SMARTer RACE方法,除了引入了高灵敏度SMARTer cDNA合成技术,还引入了长、短两个PCR引物的设计来提高PCR特异性,并利用了Clontech专利的Suppression PCR技术,以降低PCR结果的背景,使RACE实验的成功率更高。

Suppression PCR降低PCR背景的原理如下图。当SMARTer Oligo这段序列与模板的某个位置形成错配后,在后续PCR过程中,这个错配得到的非特异性产物会形成一个锅柄状结构,不能与引物混合物中的短引物结合,也就不能作为模板被扩增,从而降低了PCR背景。

在PCR扩增了cDNA末端序列后,除了对PCR产物进行测序外,还需要将PCR产物克隆至载体后进行进一步的分析。SMARTer RACE试剂盒还引入了高效的In-Fusion无缝克隆技术,让克隆更高效,更简单。

综上所述,SMARTer RACE方法的优势非常明显:

▪ 高灵敏度,RNA起始量要求低,10 ng–1 μg total RNA或 poly A+ RNA均可;
▪ 反转录酶和PCR酶的性能卓越,尤其针对于长片段和高GC含量基因;
▪ 长短两个通用引物的设计,提高PCR扩增特异性;
▪ 专利Suppression PCR技术,实现PCR低背景;
▪ 专利In-Fusion无缝克隆技术,高效完成RACE片段的克隆。

SMARTer 5’/3’RACE Kit(Code No.634858/59)包含了RACE实验所需的全部核心试剂,一个试剂盒就是一个完整解决方案:

▪ 反转录相关试剂:SMARTer first-strand cDNA synthesis reagents
▪ 高质量PCR酶:SeqAmp DNA Polymerase
▪ PCR产物纯化柱:NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit
▪ In-Fusion无缝克隆试剂:In-Fusion Cloning reagents
▪ In-Fusion克隆用线性载体:linearized pRACE vector
▪ 高效感受态细胞:Stellar Competent cells

SMARTer技术除了在RACE方面的应用外,在文库构建、PCR和qPCR、下一代测序等方面也实现了广泛应用。

更多产品信息,请参考官方网站
http://www.takarabiomed.com.cn/Product.aspx?m=20141220150704890002#p

立即索取SMARTer RACE方法的详细资料

(http://www.ebiotrade.com/)
版权所有,未经书面许可,不得转载

我来说两句(0)

[Ctrl+Enter]

加载读者评论......

相关文章:

    加载相关文章......

今日文章:

    加载今日文章......
    加载中......
    加载中......

技术期刊

GE期刊 | 基因快讯

    加载中......
    加载中......

更多>>

技术大讲堂

分子 | 细胞 | 蛋白 | 其它

    加载中......
    加载中......
    加载中......
    加载中......

更多>>

特价专栏

    加载中......

更多>>

会展信息

    加载中......

更多>>

生物通首页 | 生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 生物直通车 | 科研交流 | 正牌代理商 | 中国科学人 | 新技术专栏 | 技术讲座

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号