检测DNA与蛋白质的互作,你需要关注这些新技术[创新技巧]

【字体: 时间:2017年09月29日 来源:生物通

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  不论对何种生物而言,DNA与蛋白质之间的相互作用(DPI)都是至关重要的。你想,基因的表达、复制、重组和修复,以及RNA转运和翻译,哪个离得开这种相互作用?

不论对何种生物而言,DNA与蛋白质之间的相互作用(DPI)都是至关重要的。你想,基因的表达、复制、重组和修复,以及RNA转运和翻译,哪个离得开这种相互作用?

早在十九世纪后期,科学家们就通过显微镜观察到了蛋白质与DNA之间的相互作用。自那以后,他们开始深入探索蛋白质结合并控制DNA和RNA的机制。

总的来说,与DNA结合的蛋白是普遍存在的,大约占了高等动植物蛋白质组的10%,也就是说,各个物种平均而言约有2000个。

相互作用可能是特异性的,由核酸序列所控制,并由氢键、离子相互作用和范德华力介导。转录的控制就是一个例子。不过,也可能是非特异性的,通过蛋白功能基团与DNA骨架之间的吸引而发生。

分析方法

对于大部分的相互作用,人们只是略知皮毛。研究通常从鉴定蛋白质组分开始。常用的分析方法包括显微镜和经典的生化分析,如染色质免疫沉淀(ChIP)、指数富集的配体系统进化(SELEX)、电泳迁移率分析(EMSA)、DNase足迹分析以及蛋白结合芯片。

ChIP是让蛋白质与其DNA目标共价结合,之后将它们解交联,并分别鉴定。SELEX将目标蛋白暴露在寡核苷酸的随机文库中。之后分离出与之结合的基因并通过PCR扩增。DNase I 足迹分析定位蛋白质与DNA的结合位点,然后进行有限的DNA消化。芯片则鉴定与标记的蛋白质相关联的基因序列,随后进行荧光检测。

研究人员也采用各种显微技术来探索DNA-蛋白互作,包括光学、荧光、电子和原子力显微镜,后两者提供了最高的空间分辨率,不过,电镜仅限于静态观察,而不能分辨动态相互作用。

原子力显微镜(AFM)可以说是多功能的显微方法。它利用微悬臂感受和放大悬臂上微小针尖与受测样品原子之间的作用力,从而达到检测目的,具有原子级的分辨率,可探测单分子的分子间作用力。

瑞士洛桑联邦理工学院的科学家Sandor Kasas指出,高速AFM能够以极高的分辨率来探索蛋白质及相关基因的结构。“通过高速AFM,所有相互作用的动力学都可以被实时追踪,同时测定蛋白质与DNA之间的相互作用力。”

原子力显微镜的最新应用是将蛋白质附着在针尖,然后测定它与自由漂浮的DNA之间的互作。蛋白质样品可以是溶液形式,也可以不是,这具体取决于研究人员要寻找的目标。不过,它必须固定在底物上,才能通过显微镜观察。

在快速实验中,样品可以在空气中成像。这种情况下的附着相对比较容易。不过,若要寻找互作动力学,成像必须在液体中进行,这时附着就比较复杂。“DNA必须牢固附着在表面,才能被显微镜所看见,但又不能太牢固,以便与蛋白质相互作用。有时这挺难实现的,”Kasas补充说。

当然,原子力显微镜的价格不菲。一台低速显微镜的价格大约在10万-20万美元,这意味着许多部门需要合力才能购买一台。有些机构愿意与生物学家合作。高速显微镜则是另一码事。“它们目前还很稀少,只有几个研究组拥有,法国只有5台,而美国大概有十几台,”Kasas说。不过对于互作研究的前沿科学家而言,它们是至关重要的。


不断改进

与任何新兴的研究领域一样,实验方法必须经过千锤百炼,才能不断改进。比如ChIP技术,目前已衍生出许多替代技术,Promega公司的HaloCHIP™系统就是其中的一种。

HaloCHIP系统能共价捕获细胞内的DNA-蛋白复合物,而不使用抗体。感兴趣的蛋白与组氨酸标记的HaloTag融合表达。随后在甲醛的作用下与DNA交联,并用HaloLink树脂捕获。洗掉非特异的蛋白和DNA后,加热使得融合蛋白与DNA解离,之后进行纯化和分析。据介绍,HaloCHIP的整个过程不到48小时,步骤更少,但信噪比更高,同时最大限度减少了实验误差。

HaloCHIP后DNA序列的测定可以通过几种方式实现,这取决于您对DNA结合位点的了解。PCR、qPCR、芯片和测序都是常用的方法。您还需要适当的对照,以便了解和定量富集过程。

Promega的资深科学家Danette Daniels解释说:“人们对转录因子和表观遗传蛋白在全基因组内的结合表现出浓厚的兴趣,希望鉴定各种细胞类型和疾病状态下的结合。”此外,她指出,鉴定蛋白-RNA复合物,了解这些互作所需的RNA序列特异性,也是一个激动人心的新方向。

物理鉴定

生化分析只是DNA-蛋白质互作研究的一个方面。X射线晶体衍射等物理方法也提供了宝贵的见解。获得的晶体结构可揭示复合物所在的位置,鉴定复合物中的必需氨基酸残基。这将有助于下游的药物开发,特别是基于结构的药物设计。

然而,常规的结晶技术似乎不适用于互作研究,所得的晶体往往由单独的蛋白或DNA组成,造成假阳性。于是,维克森林大学医学院的生化教授Thomas Hollis采用了一种新颖的方法。他将一种称为不完全因子设计的实验开发技术与已知的结晶条件相结合,带来蛋白质-核酸复合物晶体筛选。

这个筛选系统包括48种筛查条件,每种条件使用不同的沉淀剂、缓冲液和盐组合,并提供1.5 mL的混合物。研究人员可将这些条件放在96孔板中进行结晶实验,以鉴定哪种条件有助于结晶的形成。

不过,筛选只是这个过程中的第一步。在确定了晶体形成的条件之后,研究人员必须进一步优化,以便产生强烈衍射的晶体。这是所有晶体筛选的限制。

(作者:Angelo DePalma / 生物通编译)

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