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单细胞RNA测序技术回顾(二):CEL-Seq

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年9月5日 来源:生物通

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  在此,我们将回顾一些重要的单细胞RNA测序技术。上一篇,我们回顾了Smart-Seq技术,这一次,我们聚焦同年发表的CEL-Seq技术。

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自2009年汤富酬等人首次报道单细胞RNA测序技术以来,许多新颖的技术被开发出来,可以更快速、更低成本地提供更多信息。这将大大增加了我们对细胞的了解。

在此,我们将回顾一些重要的单细胞RNA测序技术。上一篇,我们回顾了Smart-Seq技术,这一次,我们聚焦同年发表的CEL-Seq技术。

CEL-Seq

CEL-Seq(Cell expression by linear amplification and sequencing)恰如其名,是一种采用线性扩增的测序方法。线性扩增的主要优势是错误率比较低,不过线性扩增和PCR都存在序列偏好。

CEL-seq技术于2012年发表在《Cell Reports》上,由以色列理工学院的研究人员开发。这种方法利用带有唯一条形码的引物在单管中对每个细胞进行逆转录。在第二链合成后,将所有反应管的cDNA混合,并进行PCR扩增。扩增后DNA的双端深度测序能够准确检测两条链的序列。2014年《Science》杂志发布的MARS-seq与CEL-seq很类似。

据介绍,CEL-seq及其他线性扩增方法生成文库花费的时间要稍微长一点。不过,它在早期阶段就给样本贴上条形码并进行混合,大大减少了手动操作的时间。PCR是在最后阶段使用的,主要是为了连接正确的测序接头。CEL-seq所需试剂都是现成的,大约两天可生成测序文库和测序数据。需要注意的是,CEL-seq与大多数方案一样,测序转录本的3’ 端。

开发者Itai Yanai这样形容CEL-seq技术:你可以把人类细胞及其所包含的20,000个基因,看作是一个房间,里面有20,000个灯光开关。

他解释说:“每个房间都有不同的气氛,因为我们可以以许多不同的方式打开或关闭这些开关。这就是为什么相同的基因可以有很多不同的行为。通过这种方法,我们可以选取一个给定的细胞,并知道每个开关的位置——它是打开还是关闭,并由此推断正在进行什么功能。”

之后,Yanai及其同事利用CEL-Seq对秀丽隐杆线虫胚胎中的基因开展分析,破解了困扰科学家多年的进化难题。他们表明,内胚层的细胞首先进化,随后是外胚层,最后是中胚层。这项成果于2014年发表在《Nature》杂志上。

优点:
添加条形码和混合实现了许多不同单细胞的多重分析和研究。
由于每个细胞在单支管中处理,样本之间的污染被大大降低。
读长偏好非常低。
链特异的。

缺点:
强烈的3’ 偏好。
高丰度转录本被优先扩增。
至少需要400 pg总RNA。

CEL-Seq2

2016年,CEL-Seq技术也终于迎来了第二版。与早期的版本相比,CEL-Seq2具有更高的灵敏度、更低的成本,并且手动操作时间缩短。

研究人员在Fluidigm C1系统上开展CEL-Seq2,检测了小鼠成纤维细胞中伴随着细胞周期的基因表达变化。研究人员表明,与Smart-Seq技术相比,CEL-Seq2的灵敏度有所提高。总的来说,就经济性、分辨率和易用性而言,CEL-Seq2适合单细胞RNA-Seq分析。

(http://www.ebiotrade.com/)
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