文献选读-心肌细胞PQC相关信号通路RNAi筛选

无偏性RNAi高内涵筛选

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年1月3日 来源:BioTek

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  近期,来自辛辛那提儿童医院的Jeffrey Robbins研究团队在顶级期刊Circulation Research上发表了一篇RNAi筛选心肌细胞蛋白质质量控制(PQC)相关通路影响因素的文章,通过小鼠原代心肌细胞培养模型,高通量图像筛选方案及在线数据库分析,筛选出数个影响分子伴侣介导的自噬途径的调控因子,并最终对Jak1进行了后续验证。

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近期,来自辛辛那提儿童医院(Cincinnati Children’s Hospital)的Jeffrey Robbins研究团队在顶级期刊Circulation Research上发表了一篇RNAi筛选心肌细胞蛋白质质量控制(PQC)相关通路影响因素的文章,通过小鼠原代心肌细胞培养模型,高通量图像筛选方案及在线数据库分析,筛选出数个影响分子伴侣介导的自噬途径的调控因子,并最终对Jak1进行了后续验证。

PQC通路

PQC异常与心血管疾病密切相关,包含三种主要调控通路。

本文的研究重点是αβ-crystalling蛋白,其为小热休克蛋白家族一员,作为重要的分子伴侣参与了PQC的过程。

筛选方案流程

细胞模型:腺病毒转染CryAB缺陷的小鼠原代心肌细胞
shRNA干扰:MISSION RNAi shRNA文库

这篇文章中所有的图片获取及图像分析均由Cytation及Gen5软件担任~

CryABR120G表型分析

Gen5软件识别胞质内表达的CryAB蛋白
定量统计WT型和R120G型表型差异
R120G荧光强度显著上升,并表现出面积缩小   

温馨提示:除了定量统计细胞内CryAB蛋白的荧光强度,Gen5软件还可以给出图像单元分析的多种参数,在这里CryAB蛋白的面积皱缩变化也可以统计哦。

High Content Screen

Cytation筛选设置:4x4/well阵列成像,10x 物镜,DAPI/GFP/RFP                                 
通量:225块96孔板
Hit标准:降低50%CryAB蛋白聚集


 
后续数据库分析及验证

作者经过OMIM, EntrezGene, ToppGene, AltAnalyze等多重数据库分析和条件限制,最终选定Jak1为目标基因;

RNAi筛选的后期验证是比不可少的环节,本文后续使用siRNA干扰等技术,对Jak1基因调节CryAB蛋白表达的长期效果进行评估,并使用蛋白酶体报告基因GFPu验证Jak1对蛋白酶体Flux及自噬Flux的影响。所选则的评估方法同样是细胞成像检测。

最后,文章的附件中还详细描述了该实验中RNAi的参数优化方案,如果您正在进行相关领域的研究,欢迎点击此处索取原文或Cytation的详细资料

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