循环肿瘤细胞如何实现富集及鉴定？

1. 引言

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指由实体肿瘤上脱落下来进入血液或者淋巴系统的肿瘤细胞。CTCs数量与癌症发展进程和转移密切相关[1-3]。大量临床研究表明，对CTCs数量进行跟踪监控有助于癌症早期诊断[4,5]，预后判断[6]和药效评估[7,8]。

 图1. CTCs示意图

经过大量的临床研究，研究人员在许多恶性肿瘤（乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌等）中都发现了CTCs的存在。目前，临床上对肿瘤的检测有以下几种常规方法：影像学诊断、内窥镜检查和病理学诊断，与传统检测方法相比，CTC检测有两个明显优势：（1） CTCs检测是非侵入式的，医生或者研究人员只需要从患者体内抽取少量的外周血（几毫升左右），这一过程是无创的，而且也没有任何副作用，同一患者能够反复多次采集，不需要通过对患者进行手术或者穿刺等方式来获取组织切片。（2） 由于现在影像学等检测技术的灵敏度和精度限制，CTCs能更快地发现肿瘤的动态变化情况，有助于对肿瘤患者进行预后判断、复发风险预警和转移情况监控等。

目前，对CTCs的研究主要集中在早期筛查、辅助肿瘤分期、预后评估、个体化治疗策略制定，疗效及耐药监测、复发和转移预警等方面。

2. 原理

2.1 人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒

人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒利用密度梯度离心法，从全血样本中分离出外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），再通过偶联了抗人CD45单克隆抗体的免疫磁珠去除肿瘤病人PBMC细胞中的CD45+细胞，从而有效的富集了病人外周血标本的CTCs。本实验过程中红细胞的去除避免了低渗裂解法的使用，从而对富集的肿瘤细胞损伤降到最低，使获得的靶细胞维持了良好的自然状态及细胞形态，可以应用于后续一系列鉴定性研究。

2.2 人外周血循环肿瘤细胞鉴定试剂盒（免疫荧光法）

免疫荧光细胞化学鉴定是通过Alexa Fluor 488荧光素标记的细胞角蛋白抗体（Alexa Fluor 488-anti-CK18）、PE标记的抗人CD45抗体（PE-anti-CD45）和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，CK18表达阳性，CD45 表达阴性（DAPI+/CK18+/CD45-）的细胞被鉴定为CTC。本试剂盒对目标细胞特异性强、非常可靠的完成全血中CTC的鉴定。

3. 材料及方法

3.1 材料及实验仪器

水平转子离心机（品牌：百泰克，型号：CK4050），15ml离心管，磁力架（百泰克），移液器，采血管。

恒温培养箱，烘箱，荧光显微镜，暗盒。

3.2 方法

按照人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒（品牌：百泰克，型号：CT1001/ CT1002）使用说明书操作。

按照人外周血循环肿瘤细胞鉴定试剂盒（免疫荧光法）（品牌：百泰克，型号：CT2001/ CT2002）使用说明书操作。

4. 结果及分析

4.1白细胞去除率

进行了6组重复试验，细胞去除率如下表所示（表1），平均值96.13%。

表1. 白细胞去除率

实验编号	总PBMC数	残余细胞数	细胞去除率	平均值
1	5.08×106	1.26×105	97.50%	96.13%
2	5.08×106	1.80×105	96.46%
3	2.28×106	8.00×104	96.50%
4	2.25×106	1.30×105	94.20%
5	2.90×106	9.00×104	96.90%
6	3.05×106	1.45×105	95.20%

4.2 CTC回收率

进行了6组重复试验，CTC回收率如下表所示（表2），平均值75.63%。

表2. CTC回收率

实验编号	总CTC数		CTC检出数	回收率	平均值
1	32	22		68.80%	75.63%
2	32	27		84.40%
3	16.3	11		67.35%
4	16.3	12		73.47%
5	16.3	12		73.47%
6	21	17		80.95%
7	21	17		80.95%

4.3 免疫荧光染色结果

荧光显微镜或激光共聚焦下进行观察并采集图片，其中DAPI+/CK18+/CD45-的细胞即为CTC。

通过人外周血循环肿瘤细胞差相富集及鉴定试剂盒，可有限实现循环肿瘤细胞的富集及鉴定，具有平均回收率高、富集效果好、方法操作简便及成本低等特点。

参考文献：
[1]. Aceto N, Bardia A, Miyamoto D T, et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis[J]. Cell, 2014, 158(5):1110-1122.
[2]. Bottos A, Hynes N E. Cancer: Staying together on the road to metastasis[J]. Nature, 2014, 514(7522): 309-310..
[3]. Qian W, Zhang Y, Chen W. Capturing cancer: emerging microfluidic technologies for the capture and characterization of circulating tumor cells[J]. Small, 2015, 11(32): 3850-3872.
[4]. Hyun K A, Kwon K, Han H, et al. Microfluidic flow fractionation device forlabel-free isolation of circulating tumor cells (CTCs) from breast cancer patients[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 40(1): 206-212..
[5]. Ozkumur E, Shah A M, Ciciliano J C, et al. Inertial focusing for tumor antigen dependent and independent sorting of rare circulating tumor cells[J]. Science translational medicine, 2013, 5(179): 179ra47-179ra47.
[6]. Miyamoto  D  T,  Sequist  L  V,  Lee  R  J.  Circulating  tumour  cells  [mdash]  monitoring treatment response in prostate cancer[J]. Nature reviews Clinical oncology, 2014, 11(7): 401-412.
[7]. Toss A, Mu Z, Fernandez S, et al. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine[J]. Annals of translational medicine, 2014,2(11):108
[8]. van de Stolpe A, Pantel K, Sleijfer S, et al. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use[J]. Cancer research, 2011, 71(18):5955-5960.