三招教您选对化学发光底物,附赠高频问题指南[心得点评]

【字体: 时间:2018年10月18日 来源:生物通

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  在如今的Western blot实验中,化学发光检测是最常用的检测方法。不过,问题又来了。面对市场上林林总总的化学发光底物,我们该如何选择呢?在使用过程中又需要注意哪些问题?本文将一一为您解答。

Western blot(免疫印迹)尽管是各大实验室的常规实验,但却往往不尽如人意。配胶和转膜就是一个大坑,一不留神就掉坑里。万一再遇上劣质抗体,那时间精力都白费了。既然各个环节都那么费神,那么检测过程当然要轻松一点。

在如今的Western blot实验中,化学发光检测是最常用的检测方法。相对于显色检测和荧光检测而言,它的灵敏度非常高,可达到飞克级(fg)。自从增强型化学发光(ECL)检测问世以来,这种方法就受到了全世界科研工作者的喜爱。

化学发光检测通常使用的是辣根过氧化物酶(HRP)。它催化底物鲁米诺(luminol)的氧化,同时生成光信号。这些信号可通过X光胶片的曝光来检测,或直接在与化学发光兼容的CCD成像系统上获取图像。当然,后一种方式更方便,也更流行。

三大选择要点

不过,问题又来了。面对市场上林林总总的化学发光底物,我们该如何选择呢?其实,大体上只需要考虑几个因素:

检测灵敏度:灵敏度当然是高些更好。若条带模模糊糊、若有若无,你该如何跟老板解释?选择高灵敏度的底物,就能够避免这种尴尬,比如赛默飞世尔科技的SuperSignal West Pico PLUS底物,它能够达到低皮克级至高飞克级的灵敏度。如果是丰度极低的蛋白,那必须尝试下SuperSignal West Femto底物。这种“超强信号”的底物能够达到低飞克级,超微量靶点也不在话下。

信号持续时间:发光信号的持续时间是越长越好。以前化学发光试剂的发光时间大多只有几十分钟,如今经过改进,许多试剂的发光时间都可以达到几小时。在优化的体系中,SuperSignal West Dura底物产生的信号甚至长达24小时,真是超长待机的模范。当需要长时间或者多次成像时,信号持久度是重要的考虑因素。因此,如果您常常需要过夜压片或者多次曝光,选择一款信号持久的底物往往会得到更好的体验。

性价比:无论是买白菜,还是买试剂,终归还要讲究性价比。同样是化学发光底物,有些灵敏度高、信号稳定、能够节省抗体,因此即使价格略高,但单次实验的总成本并不高。当然,若靶点丰度极低,非常珍贵,那也只能狠狠心,花大价钱购买灵敏度最高的底物。如果出于价格在这个环节将就了,导致实验最终失败在检测环节,那么损失的时间和试剂成本可就远高于底物了。

高低搭配,相得益彰

其实,没有一种底物能完全满足所有Western blot的需求。大家不妨在实验室中常备SuperSignal West Pico PLUS这样的底物来进行常规的检测。它具有低皮克级的灵敏度和较长的信号持续时间,不仅能满足大部分日常实验的需求,也是新靶点检测的理想之选。

同时,还建议一起购置超敏底物,如SuperSignal West Femto底物,以便在Western blot出现白板的伤心时刻,用它们来即刻拯救你,如果超敏底物也检测不出,那么再去排查抗体或样本的问题;或者应对某些已知丰度极低的靶点,避免浪费宝贵的样本。这些试剂盒在保存良好的情况下,保质期可长达一年,所以不用担心过期哈。

表1:SuperSignal系列化学发光底物选择指南

 

SuperSignal West Pico PLUS底物

SuperSignal West Dura底物

SuperSignal West Femto底物

灵敏度

低皮克级至高飞克级

中飞克级

低飞克级

信号持续时间

6-24小时

24小时

8小时

检测方法

X光胶片、

CCD成像仪

X光胶片、

CCD成像仪

X光胶片、

CCD成像仪

一抗稀释度*

1:1,000-1:5,000

1:1,000-1:50,000

1:5,000-1:100,000

二抗稀释度*

1:20,000-1:100,000

1:50,000-1:250,000

1:100,000-1:500,000

适用情形

需要比入门级ECL底物更高的灵敏度,可检测范围更广

靶点丰度较低,样品有限,需要进行CCD图像捕获

靶点丰度极低,样品稀缺,需要获得最高的灵敏度

产品优势

超值之选,满足绝大部分常规检测的需求

最佳的信号持久度

最高的检测灵敏度

* 抗体浓度为1mg/mL

图1. SuperSignal™ West Pico PLUS的信号稳定持久。使用2倍梯度稀释的HEK 293或HeLa细胞裂解物进行靶点的检测 (起始量分别为4 µg /孔或20 µg /孔)。SDS-PAGE分离后,使用Invitrogen Power Blotter (货号:PB0113) 和一步法转印缓冲液 (货号:84731) 将蛋白质转印至PVDF (货号:88518) 或硝酸纤维素 (货号:88018) 膜上。使用5%脱脂奶粉 (溶解于稀释至1X的Pierce 20X TBS Tween 20 缓冲液中,货号:28360) 封闭膜,使用Invitrogen β-Catenin抗体 (货号:MA1-300)、STAT3抗体 (货号:MA1-13042) 或WNT1抗体 (货号:MA5-15544) 孵育,然后使用浓度为20 ng/mL的HRP标记山羊抗小鼠IgG (H+L) 二抗 (货号:31430) 孵育。使用SuperSignal West Pico PLUS底物孵育5分钟后,进行化学发光检测。在达到所示的时间点时,在X光胶片上采集信号。

底物使用Tips

1. 二抗浓度不要太高,否则容易导致信号丢失。这听上去似乎不合常理,但实际情况是,局部高浓度的HRP在催化底物的同时也会产生大量的自由基,自由基可以导致HRP被氧化并被失活,进而导致信号输出的衰减。同理,若信号迅速衰减,也可以尝试减少二抗的用量。

图2. 信号发射曲线示例。当免疫印迹体系中存在过量的酶时,会在加人底物后迅速达到信号峰值,并迅速耗尽底物(信号1)。在理想的体系中,信号强度会在加入底物约5分钟后达到峰值,并维持若干小时的平台期(信号2)。

2. 在使用灵敏度更高的底物时,需要同时调整体系以适应底物灵敏度,否则就会产生高背景。大家在使用时要留意说明书上建议的一抗和二抗稀释度。使用最佳的抗体浓度可以促进靶点特异性的结合,并降低背景。

3. 大家应该克制住使用超敏底物的冲动。超高灵敏度的底物并非万金油,仅仅适用于低丰度或难检测的蛋白。当它们用于高丰度的蛋白时,可能适得其反,产生脏脏的结果。因此,适合的才是最好的。

4. 千万不要稀释底物。首先,这会造成检测体系的不稳定。其次,底物的稀释比例与信号强度之间没有绝对的相关性,比如底物稀释为原浓度的1/2,而信号并不是减少一半,极易导致实验结果难以重复。

从过去的Pierce到现在的赛默飞,SuperSignal系列的化学发光底物一直被研究人员所信赖,在过去三年已经被主要学术期刊中的7,000多篇参考文献引用过。因此,它们定能帮助你跳出大坑,收获高质量的Western blot结果。(生物通 余亮)

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