单细胞转录组测序的最新进展盘点

【字体: 时间:2018年10月25日 来源:生物通

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  单细胞转录组分析(scRNA-seq)尽管是一项相当年轻的技术,但商业化的scRNA-seq平台正在不断涌现,而生物信息学方案也越来越多。现在就让我们来盘点一下最新的研究进展。

单细胞转录组分析(scRNA-seq)尽管是一项相当年轻的技术,但商业化的scRNA-seq平台正在不断涌现,而生物信息学方案也越来越多。现在就让我们来盘点一下最新的研究进展。

SPLiT-seq:成本低至一美分

艾伦脑科学研究所的副主任Bosiljka Tasic指出,全基因组的单细胞分析目前很受欢迎。它让人们了解整个系统中的单个组分,也就是单细胞。与PCR和原位杂交等技术不同,全基因组分析无偏向地告知了细胞正在表达什么,而不需要你去选择分析什么。

现在有许多平台和技术可用于制备测序用的单细胞RNA。这些技术大体是在微孔板的各个孔中分离单个细胞,或者使用微滴来充当单个细胞的反应室。无论采用哪种方式,Tasic认为关键是在分析的某个时刻将细胞分离并添加条形码,这样才能将RNA序列分配到它们当初来源的那个细胞。

Bosiljka Tasic联合华盛顿大学的Georg Seelig团队开发出一种称为SPLiT-seq的技术,其中细胞本身作为反应室。这种技术将细胞或细胞核固定,以便捕获RNA,不过洗涤试剂可以进进出出。通过一系列合并和分离的步骤,它开展逆转录并连接条形码标签,最终进行裂解和PCR(使用条形码引物)。

SPLiT-seq技术于今年3月发表在《Science》杂志上。据Tasic介绍,这是一种低成本的技术,每个细胞的建库成本低至一美分(约合人民币七分钱),大大降低了实验室开展单细胞分析的门槛。“真正强大的是它几乎无需任何特殊仪器,”Tasic补充说。

研究团队利用SPLiT-seq技术对出生后第2天和第11天小鼠大脑和脊髓组织的细胞核进行分析。他们成功地鉴定出100多种细胞类型,其基因表达模式与细胞功能、区域特异性和分化阶段相对应。这些数据可用于创建基因表达图谱,与艾伦研究所的其他参考图谱互补。

snDrop-seq:单核RNA测序

加州大学圣地亚哥分校的张鹍(Kun Zhang)团队则关注人体组织的单细胞分析。“你需要将细胞彼此分离,才能开展各种单细胞分析,”他说。不过,大脑组织很难解离,“这就使结果存在很大的偏向性,因为有些细胞分离,而有些细胞则彼此相连。相比之下,提取完整的细胞核则相对简单”。

他们采用了一种经过改进的snDrop-seq方案,希望破坏微滴中的核膜,并尽量避免RNA降解。“常规的Drop-seq或10X Genomics方案不行,因为膜不会破裂,”张鹍解释说。目前有几种方法可以完成这项任务,比如改变微流体芯片,让核膜在机械力作用下分解。“我们实际上提高了温度来破坏核膜。”

他们同时开展了snDrop-seq和scTHS-seq,后者为染色质开放性检测。“这使得我们能够在RNA水平和染色质水平上比较这些单细胞,”张鹍指出。他们能够重建各种脑细胞的表观遗传图谱,并利用单细胞多组学方法将风险因素与特定的细胞类型相关联,了解神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞对阿尔茨海默病、自闭症或精神分裂症等病的贡献。

Smart-seq2:处理少量样本

Wellcome Sanger研究所的Adam Reid及其同事想要了解疟疾生命周期中的遗传控制。 通过测序不同步的单细胞并分析转录组,他们发现寄生虫阶段的发育实际上有很大的变化。“如果对大量RNA进行测序,这一点并不明显,”研究人员谈道。

他们对低通量的Smart-seq2方案进行了修改,目标是分析每个阶段的100个细胞。 Reid表示,与高通量的10X Genomics或Drop-seq平台相比,“你可以获得更多关于哪些基因表达以及表达丰度如何的信息”。

引起疟疾的疟原虫非常小,含有极少量的RNA,并且基因组偏向性非常明显,GC含量 低至20%,而哺乳动物大约是35-40%。因此,建库的试剂往往不能很好地发挥作用,不过通过增加PCR循环次数和尝试不同的酶,研究人员还是很好地解决了这一问题。

生物信息学工具:ASAP

人们也许会对scRNA-seq望而却步,因为需要购买复杂的仪器和掌握生物信息学流程。有时,生物学家和信息学家之间的沟通“非常糟”,瑞士生物信息学研究所的负责人Bart Deplancke回忆说。在准备开展脂肪组织的单细胞转录组学研究时,他们有许多数据集需要处理,却发现其合作者往往无法开展。

于是,他们着手安排合作,让两类研究人员能以更直观的方式观察和处理数据。他们开发出一个名为Automated Single-cell Analysis Pipeline(ASAP)的平台。这是一个基于Web的完整流程,提供了标准工具,包括过滤、降维、聚类、差异表达和功能富集。它能够与各种数据库交互,并以2D或3D显示结果。“对于每个步骤,我们都提供了基本教程,它将告诉你每种分析工具能做什么,”Deplancke说。

他指出,“即使是生物信息学家也很喜欢用,因为它能够快速处理和查看数据。然后他们与生物学家一起观察数据,提出一些新的假设,并通过实验或计算手段来进一步证明它。”

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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