BioTechniques：超高分辨率显微镜的新进展

近年来，超高分辨率显微镜（super-resolution microscopy）因进展迅速而频频登上头条。它突破了Ernst Abbe的衍射极限，让显微镜从此步入了纳米时代。在最新一期的《BioTechniques》杂志上，Abigail Sawyer和Joseph Martin介绍了显微镜的最新进展。

2014年，Eric Betzig、Stefan Hell和William Moerner三名科学家因在此领域的贡献而被授予诺贝尔化学奖。然而，超高分辨率显微镜也同样存在限制。用Betzig的话来说，人们总说眼见为实，但是对于细胞生物学而言，更合适的说法是“我们何时才能相信我们所看到的”。

超高分辨率显微镜在活细胞成像上面临许多挑战。人们试图观察天然环境下的活细胞，但许多环境因素会影响生物体的生理学。这些显微镜也使用非常强烈的光线，这使得人们不容易看到细胞的天然状态。此外，显微镜太慢，无法跟踪移动的细胞，会造成图像模糊。

为此，化学家、物理学家一直在与生物学家合作，开发和改进当前的显微镜技术，以确保我们真的能够相信我们所看到的。

细胞：3D电影的主角

今年早些时候，诺奖得主Eric Betzig教授领导的团队开发出一款很快的显微镜，能够跟踪和记录生物系统中的细胞。他们结合了两种成像技术，以创建天然环境下的细胞3D图像。这项成果发表在《Science》杂志上。

为了使细胞的周围环境不被扭曲，研究人员使用了自适应光学（AO）技术。这种技术之前为天文学家所使用，提供了太空中遥远物体的清晰图像。它能够帮助解决扭曲问题，并校正图像。

他们将其与格子光片显微镜（lattice light sheet microscopy）相结合。这种技术让一层薄光以非常高的速度不断地穿过活体组织，从而将光线对细胞的损伤降至最低水平，同时获取一系列2D图像，以制作高分辨率的3D电影。

利用这种名为AO-LLSM的显微镜，研究人员能够窥视生物体的内部，以前所未有的3D分辨率观察细胞内的相互作用，比如吞噬糖颗粒的免疫细胞，以及癌细胞沿着血管滚动，试图粘附在血管壁上。

将分辨率推向新高度

普渡大学的研究人员最近开发出一种超高分辨率的“纳米显微镜”，能够提供比以往更清晰的大脑分子3D视图。这种技术帮助研究人员更好地了解阿尔茨海默症患者大脑中的斑块结构，确定可能造成损伤的特征。

传统光学显微镜的分辨率有限，脑组织的自然厚度影响研究人员清楚观察淀粉样斑块的3D形态。“对于单分子超分辨率成像而言，脑组织格外具有挑战性，因为它被细胞内外的成分封住，造成光线扭曲和散射，”普渡大学的Fang Huang评论说。“虽然你可以看到组织深处，但图像却很模糊。”

这种超高分辨率纳米显微镜采用自适应光学技术，通过改变形状的镜子来补偿光扭曲，也称为“像差”。为了补偿脑组织引起的像差，研究团队还开发了新技术，根据样本深度来调整镜子。这些技术有意引入额外的像差，以维持单个分子携带的位置信息。

之后，研究人员观察了带有阿尔茨海默病特征性斑块的小鼠。通过3D重建，他们发现淀粉样斑块通过细小的纤维缠绕周围组织。这种纳米显微镜的分辨率比传统显微镜高6-10倍，它能重建整个组织、细胞和细胞组分，使小鼠大脑额叶皮层厚度达30 μm的脑切片依然清晰可见。

全内反射荧光显微镜

美国生物医学成像和生物工程研究所的研究人员近日将两种不同的显微镜技术相结合，为细胞内快速移动的过程创建更清晰的图像。

他们在《Nature Methods》上介绍了对传统全内反射荧光（TIRF）显微镜的改进。这种技术是利用全内反射产生的消逝波来激发样品，从而使样品表面数百纳米薄层内的荧光团受到激发，大大提高荧光成像的信噪比。

不过，TIRF显微镜的缺点在于它无法捕获快速移动的物体，因此不适用于细胞过程的成像。生物医学成像和生物工程研究所的Hari Shroff想到，如果按照TIRF显微镜来改造超高分辨率显微镜，那么就能同时获得两种技术的好处。

Shroff实验室在2013年开发了瞬态结构照明显微镜（iSIM），能以每秒100帧的速度捕获视频。不过，在对比度方面，iSIM不及TIRF显微镜。因此，研究人员用简单的mask来阻挡iSIM的大部分照明。这种组合允许他们以类似的分辨率观察快速移动的物体，但速度比其他显微镜快了10倍。

这项新技术有着广阔的应用前景，可用于跟踪人体细胞质膜附近的快速移动的Rab11颗粒，这些颗粒在其他显微镜下往往模糊不清。利用新的显微镜，Shroff和他的团队揭示了HRas的动力学和空间分布，这是一种促进癌症肿瘤生长的蛋白质。

作者认为，显微镜领域在不断地发展，并且速度惊人。即使不是现在，在不久的将来，我们也可以自信地说，我们能够相信我们所看到的。（生物通 薄荷）

相关文献

1. Liu T-L, Upadhyayula S, Milkie DE et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science 360, 6386 (2018).

2. Mlodzianoski MJ, Cheng-Hathaway PJ, Bemiller SM et al. Active PSF shaping and adaptive optics enable volumetric localization microscopy through brain sections. Nat. Methods doi:10.1038/s41592-018-0053-8 (2018).

3. Guo M, Chandris P, Giannini JP et al. Single-shot super-resolution total internal reflection fluorescence microscopy. Nat. Methods doi:10.1038/s41592-018-0004-4 (2018).