微孔板检测在生命科学研究中的应用

【字体: 时间:2018年11月09日 来源:生物通

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  如今的微孔板检测仪提供多种检测模式,包括光吸收、荧光和发光检测等,可应用在生命科学研究的各个方面。现在我们就来介绍一下微孔板检测的几大类应用。

以微孔板的形式开展分子和细胞分析已然成为当下的热潮。这不仅能够大大提高通量,还能够减少试剂用量和降低实验成本。如今的微孔板检测仪提供多种检测模式,包括光吸收、荧光和发光检测等,可应用在生命科学研究的各个方面。现在我们就来介绍一下微孔板检测的几大类应用。

细胞研究

对于生命科学研究而言,细胞是不可或缺的一部分。在开展细胞相关的实验时,人们除了检测细胞增殖外,还广泛使用各种荧光染料、荧光蛋白以及抗体来检测细胞数量、细胞状态以及蛋白靶点的活性。因此,微孔板检测主要应用于细胞活力、细胞增殖、细胞凋亡的检测,以及信号通路的分析。

细胞活力

健康的细胞才能保证高品质的实验结果。因此,细胞活力的评估是许多实验的必备环节。代谢活性通常被认为是细胞活力的指标,这可通过细胞还原电位来评估。此外,评估细胞膜完整性也是一种简便的方法。在此过程中,微孔板检测提供了整个细胞群的信息,而不是跟踪单个细胞的行为。

活细胞固有的还原能力可作为代谢活性的指标。在测定细胞群体的还原电位时,信号与活细胞的数量成正比。在某些情况下,细胞需要进行下游的功能分析,此时可选择无毒性的检测试剂alamarBlue™。它操作简单,免裂解,无毒性,适用广泛,可检测哺乳动物细胞、植物、细菌、真菌等。若希望超快速检测,则可以选择PrestoBlue™,最短10分钟即可对活细胞进行实时检测。

细胞膜完整性也是细胞活力检测的通用指标。只有在细胞膜受损时,DNA结合染料才能进入细胞,因此DNA染色可作为细胞死亡的标志。利用赛默飞LIVE/DEAD™试剂盒,通过微孔板检测可测定活细胞所占比例,快速灵敏,适用于细胞、细菌和酵母。另外,还可以定量上清液中的可溶性胞质酶,如乳酸脱氢酶(LDH)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。赛默飞也提供相关的检测试剂盒。

细胞凋亡

细胞凋亡早期的一个显著特征是Caspase酶的激活,它参与蛋白底物的裂解和随后的细胞解体。微孔板检测可以对活细胞以及细胞裂解液或提取物中的活性Caspase进行分析。基于微孔板的caspase分析通常是采用荧光和显色检测。它利用caspase酶的活性和特别设计的报告底物来产生荧光或显色的信号,这可通过微孔板检测仪来读取。

CellEvent™ Caspase-3/7 Green检测试剂针对细胞凋亡分析进行了优化,采用免洗涤的简单方案,有助于保护脆弱的凋亡细胞。通过测量荧光强度,它可以实时监测微孔板各孔中活细胞的凋亡活性。若研究对象是细胞裂解液,则可选择EnzChek™ Caspase-3 Assay Kit,利用罗丹明110或AMC来报告caspase-3的活性。

细胞增殖

细胞增殖分析对于细胞的生长和分化研究是至关重要的,在药物开发期间常用于评估化合物毒性和肿瘤细胞生长的抑制。增殖检测通常是基于DNA含量或细胞代谢,或者是定量DNA的合成。通过微孔板检测平台,人们可高通量地开展细胞增殖、细胞毒性或药物功效研究。

CyQUANT™细胞增殖检测提供了一种基于细胞DNA含量的微孔板荧光检测方法。由于单个细胞DNA含量是高度保守的,在多个时间点开展CyQUANT检测就能计算出细胞群体的平均增殖速度。此外,CyQUANT染料与DNA的结合与细胞代谢状态无关,因此可比较一系列条件和细胞类型之间的信号大小和荧光强度。目前有多款CyQUANT试剂盒可供选择,适合多天检测或实时检测。

 
图3. CyQUANT细胞增殖分析试剂盒的检测流程

检测新合成DNA也是一种准确分析单个细胞或细胞群细胞增殖的方法。Click-It™ EdU分析是将核酸类似物EdU整合到DNA内,以此来测定新DNA的合成速率。与传统的BrdU检测相比,这种方法更加温和,无需变性或酸处理。Click-iT EdU Microplate Assay针对微孔板检测进行了优化,具有信号放大,其快速简便的流程适合高通量筛选。


代谢产物

代谢研究也是当下的热点。微孔板检测可以灵敏地检测各种代谢分析物,包括葡萄糖、半乳糖、胆固醇、谷氨酸、黄嘌呤/次黄嘌呤、尿酸、胆碱和乙酰胆碱,以及过氧化氢。Amplex™ Red试剂是一种无色底物,反应后荧光增加,这很容易通过微孔板形式检测到。它的发射光为红色,样本中自荧光干扰很小,且信号对pH值或还原剂不敏感。

针对神经生物学研究,赛默飞以Amplex™ Red为基础开发了一系列试剂盒,分别检测乙酰胆碱、胺氧化酶以及谷氨酸。对于炎症研究,一系列检测神经氨酸酶、黄嘌呤或次黄嘌呤、过氧化氢酶和鞘磷脂酶活性的试剂盒也已经开发出。


图4. Amplex™ Red Glucose⁄Glucose Oxidase Assay Kit的剂量-反应曲线和低水平时的灵敏度(小图)。

酶活性检测

酶活性检测也是微孔板检测的另一大类应用。利用荧光报告基因,人们可高通量检测各种酶的活性,包括蛋白酶、胶原酶、胰肽酶、溶菌酶、逆转录酶、β-半乳糖苷酶等。

EnzChek™ Protease Assay Kit含有一种酪蛋白衍生物,采用绿色荧光的BODIPY™ FL或红色荧光的BODIPY™ TR-X染料标记。在检测后,观察到的荧光增加与蛋白酶活性成正比。这种检测不涉及到任何分离步骤,因此可用于连续测定。此外,还有一系列EnzChek™ Assay Kit,可检测胶原酶、弹性蛋白酶、溶菌酶和逆转录酶。


图5. 利用EnzChek™ Elastase Assay Kit检测猪胰腺的弹性蛋白酶。
将试剂盒中的荧光标记弹性蛋白与各种浓度的弹性蛋白酶一起孵育,并测定荧光。

核酸定量

对于分子生物学实验室来说,准确高效的核酸定量是至关重要的。微孔板检测也可以定量分析核酸,用于PCR/qPCR、克隆、测序等实验。与常用的紫外吸光法相比,微孔板检测不仅能够区分DNA和RNA,还能准确定量双链DNA和单链DNA,对某些实验来说可谓福音。

PicoGreen™试剂可以准确定量dsDNA,比传统方法灵敏很多倍,并且可针对不同浓度范围进行优化。OliGreen™试剂则可以准确定量ssDNA,适用于反义寡核苷酸、适体、PCR引物、测序引物和单链噬菌体DNA的定量。RiboGreen™试剂是在Northern blot分析、S1核酸酶分析、RNA酶保护分析、RT-PCR之前快速定量RNA的理想选择。


图6. PicoGreen™ dsDNA定量试剂对小牛胸腺DNA的线性定量,从25 pg/mL到1,000 ng/mL。

蛋白定量

在凝胶电泳或western blot分析之前,定量蛋白也同样重要。基于微孔板的检测不仅能快速定量蛋白水平,而且有多种形式可供选择。通常,人们需要根据样本中的其他组分来选择合适的检测。

CBQCA蛋白定量试剂盒可准确检测10 ng至150 mg的蛋白、脂蛋白或脂质-蛋白混合物。Quant-iT蛋白分析试剂盒对蛋白具有高选择性,耐受常见的污染物,如盐、溶剂或DNA(但不包括去垢剂),并且信号稳定3小时。NanoOrange蛋白定量试剂盒则与还原剂相容,并且不受到核酸干扰。


图7. 利用CBQCA蛋白定量试剂盒检测牛血清白蛋白(BSA)。大图显示BSA的检测浓度为50 ng至1,000 ng。
小图A表示检测上限可扩展至150 μg。小图B表示检测下限可延伸至10 ng。

此外,微孔板检测还可以应用在信号通路、活性氧物质、离子指示剂等方面的检测,真可谓“一机在手,检测无忧”。既然实验室已经购置了微孔板检测仪,那么就不妨多多用起来,让它最大限度地发挥作用。

微孔板检测的更多精彩内容请看:https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/fluorescence-microplate-assays.html

(生物通 余亮)

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