EPR创新应用：高精度追踪ROS/RNS自由基

　　

作者：Fabrice Moriad，Bruker BioSpin公司基于片段的药物发现产品经理

简介

氧化应激和细胞损伤与癌症、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、自闭症、感染和帕金森病的发展有关。活性氧（ROS）是引发细胞氧化应激和损伤的主要原因，会对蛋白质、脂类和DNA造成损伤。由于对此类疾病的现有治疗方法收效甚微，因此有必要开发出基于新靶标的新药物。

在生物系统中测量ROS和活性氮（RNS），主要是为了确定它们是否在生理或病理生理过程中发挥作用。生物材料中的自由基的检测与表征最常采用的是EPR（电子顺磁共振）法。EPR光谱的应用范围十分广泛，从质量控制到分子研究等领域，如材料研究、结构生物学以及量子物理。大多数生物相关性自由基的寿命都非常短，因此，无法在生物样本中检测出来。由于这个原因，已使用化合物（自旋捕获剂和自旋探针）与自由基形成稳定的加合物。不幸的是，自旋捕获剂通常对ROS的反应性较低，并且所形成的自由基加合物在暴露于细胞或组织时极易发生生物还原，被转化为无EPR信号的物质（参见图1）。

图1：EPR静默与EPR激活

在本文中，我们将明确与ROS检测相关的挑战，并将重点描述三个有关如何利用EPR了解自由基过程例子。此外，本文还将展示应用于台式EPR仪器的最新数字和微波技术是如何赋予研究人员有关ROS和自由基的新洞察力，这将会带来未来医药及医疗领域更有效的疗法的发展。

为什么ROS研究十分重要？

在过去十年中，人们对活体系统中自由基过程的兴趣呈指数级增长。由于演化过程存在巨大的复杂性，因而从根本上对问题分析变得十分必要。自由基是各种生化反应的中间产物。在自然生化反应中产生的最丰富的自由基是ROS（如羟基、氢过氧化物和超氧自由基），以及RNS（如一氧化二氮和过氧亚硝酸盐）。对自由基进行快速而严格的检测与量化将使我们能更好地了解化学生物学，也将有助于发现特定的抑制剂。识别过度、有缺陷的或不平衡的ROS和RNS水平的根源，并制定出调节其各自水平的替代策略会有助于设计新的合理疗法。1

EPR在生物医学中的应用

因为ROS和RNS的半衰期很短，室温下在溶液中对其进行直接检测是非常困难甚至不可能的。EPR是直接检测顺磁性物质的唯一方法。EPR实验提供了有关金属蛋白结构以及光合作用过程及其中起主要作用的蛋白的结构的宝贵信息。在生物学上，EPR可应用于对膜蛋白、金属酶、IDP、RNA、DNA、自旋标记/捕捉剂、一氧化氮、ROS和RNS的研究。攻克ROS识别难关是发展有效疗法的关键因素。无论应用的重点是什么，对EPR波谱仪的关键性要求都离不开强度、灵敏度和稳定性。磁体与微波技术方面的创新有助于提供更高的性能，能满足研究人员便捷使用高质量EPR数据的需求。

EPR被用于材料、化学物质和生物系统的静态和动态研究，包括分子自由基的结构和形成。因为当外界条件（如温度或光照）变化时，也可进行EPR波谱检测，因而EPR有利于动态检测。应用包括聚合物合成、测试太阳能电池中硅的纯度、自旋捕获以评估香料的氧化稳定性，以及金属蛋白的分析。在电化学、氧化还原化学、光化学和催化方面，EPR可用于研究化学过程中所涉及的金属中心和自由基。

新的应用重新唤起了将EPR作为化学、材料科学和生物学分析工具的兴趣，以上领域的科学家和研究人员已经发现了利用新的高性能紧凑型台式EPR仪器带来的好处。台式EPR波谱仪可用于分析多种EPR样本，包括过渡金属、抗氧化剂和自由基，可为生物和化学系统提供有价值的信息和洞察力。较新的台式仪器，如来自Bruker的EMXnano，得益于集成新颖的永磁体和高效的新型微波谐振腔，为台式EPR系统提供了高灵敏度和稳定性，使其适用于广泛的分析、教学应用，并凭借自旋定量模块实现了EPR量化。

依靠新一代的磁体系统和高效微波谐振腔，可在台式设备上获得准确的结果和优越的灵敏度。这使得研究、教学或过程应用均能受益于EPR自旋捕获波谱技术，也使得EPR经验有限的研究人员和学生能够利用强大的EPR自旋捕获波谱技术，来识别并量化生物系统（蛋白质、血液、组织等）中的自由基。

应用实例

以下应用展示了EPR波谱（也称为电子自旋共振、ESR、波谱）是如何应用于生物系统中的自由基检测与表征的。

1、定量EPR自旋捕获应用

正如以上所讨论的，由于其极短的半衰期，室温下在溶液中直接检测ROS和RNS是非常困难甚至不可能的。以下在黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统中显示的两种主要ROS为超氧自由基（O₂^•-）和羟基自由基（•HO）（图2），其生成和分解可通过量化EPR加以准确跟踪。

图2：在给定时间内，2D场对时间实验中黄嘌呤氧化酶中DMPO自由基（超氧和羟基）加合物的实验数据（红）和SpinFit模拟（蓝）。通过从数据库中导入在SpinFit对话框中确定DMPO自由基加合物。

解决方案：
EPR自旋捕获是在1960年代后期发展起来的一种技术，其中硝酮或亚硝基化合物与目标自由基反应以形成可通过EPR波谱学检测出的稳定且可区分的自由基。自旋捕获反应涉及将活性自由基加入反磁性“自旋捕获剂”的双键中，形成可通过EPR进行研究的更稳定的自由基。这种“自由基加合物”具有波谱特征，从而能很容易地识别出最初产生的活性自由基。

2、EPR自旋探针的应用

在血管细胞中，超氧化物（O₂^•-）的升高已表明了高血压、糖尿病和心力衰竭的发生。因此，准确的O₂^•-检测和量化能力对于了解这些心血管疾病以及其它非心血管疾病的发病机制至关重要。然而，由于其极短的半衰期，室温下在溶液中直接检测ROS和RNS是非常困难甚至不可能的。如下所示（图3），利用台式EPR波谱仪可以很容易地监测超氧化物随时间产生的情况。

图3：由于CHM + O₂^•- ● CM + H₂O₂反应在2D场对时间实验中CM●氮氧化物的形成与时间的函数关系。SpinFit和SpinCount计数模块提供ROS浓度用于在反应期间任何给定时间点的量化EPR分析。

自旋探针并非自旋捕获剂，因为它们不会“捕获”自由基，但它们被氧化形成半衰期为数小时的氮氧化物（自由基），可以很容易地通过EPR检测出来。例如，环羟胺1-羟基-3-甲氧羰基-1,2,5,5-四甲基吡咯烷（CMH），可以提供高灵敏度的超氧化物（O₂^•-）的定量测量，并已被用于检测培养细胞和组织样本中的细胞内O₂^•-：

台式EPR波谱仪可以有效用于酶反应中产生的多种自由基（ROS和RNS）的机制研究和动力学分析。适当控制的自旋探针实验可以验证自由基加合物的形成是由于正在被研究的反应体系中自由基的产生。

3、一氧化氮的应用

人体皮肤含有对光不稳定的一氧化氮（NO）衍生物，在高通量NO形成及运用NO特异性生物反应（如局部血流量增加或血压降低）情况下，会因UVA辐射而分解。使用EPR可以监测并量化由于人体皮肤受蓝光照射引起的皮内游离NO的增加情况。

一氧化氮（NO）是一种高度反应性的调节分子，它具有许多重要的生理作用，如中枢神经系统中的神经传递素、心血管系统中血管舒缩调节因子，以及免疫系统中的细胞毒性介质。NO是一种自由基，其较短的半衰期（＜30秒）使直接测量非常困难。NO的不稳定性可以通过使用NO捕获技术加以克服，形成更稳定的复合体并随后通过EPR进行检测。例如，一氧化氮（NO）通过氧合血红蛋白（oxyHb）氧化为硝酸盐是NO的基本生物学反应，而NO与血红素的结合可以通过EPR来表征。

EPR为室温和低温技术提供了高灵敏度的NO检测手段。借助用于室温和低温测量的附件，用MGD或血红蛋白作为自旋捕获剂可以很容易实现地实现对NO的检测。

台式EPR

根据用户对于研究性能和易用性的要求，已经设计出了台式EPR波谱仪。台式仪器提供了许多通常只能在复杂的落地式EPR仪器上找到的特性，使更大范围的科学家能接触到研究级EPR能力。台式仪器通常包括明确的工作流程以实现便捷的系统设置，依靠友好的用户界面，即使不是EPR专家也能很容易地进行参数调整。

结论

随着全球对疾病新疗法需求的持续增长，主要是由于高死亡率以及与疾病相关的医疗费用增长的驱动，研究者们将其研究重点放在疾病动力学上。EPR处于变革的前沿，被普遍认为是检测和鉴定生物系统中自由基的“黄金标准”。

在用于生物研究时，EPR波谱和相关方法的有利方面可被用于使有效信息最大化，并使假象最小化。该技术可提供关于生物系统中自由基和一些过渡金属离子的丰富而有价值的信息。它能提供关于存在的物质身份的明确信息，以及关于其浓度、结构、迁移率和相互作用的信息。

该技术已被用于许多临床领域的告知研究，最显著的包括癌症、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、自闭症、感染和帕金森病。EPR仍然是确定复杂系统中自由基的决定性方法，也是研究自由基动力学、浓度和结构的一种有价值的方法。展望未来，这些创新必将使研究者掌握更有力的数据，进一步加速药物的开发和告知临床实践。

参考文献
1. Rouaud, F. et al., (2014) Regulation of NADPH-dependent Nitric Oxide and reactive oxygen species signalling in endothelial and melanoma cells by a photoactive NADPH analogue, Oncotarget 5 (21): 10650 – 10664.

供进一步阅读的参考文献
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