通过新一代测序来分析拷贝数变异

【字体: 时间:2018年12月25日 来源:生物通

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  自从发现HER2基因扩增并将其作为治疗靶点以来,测定拷贝数变异的技术在不断发展。利用最新的高通量拷贝数检测方法,人们可以更好地鉴定这些重要的基因变异,并深入了解它们与疾病的关系。

对于精准医疗而言,理想的情况是测定每位患者的遗传变异,并根据结果及其他因素开出适当的药物。具体到癌症,遗传变异包括单核苷酸替换和插入/缺失、基因拷贝数变异、部分或整个基因缺失、大的染色体区域的重复或缺失,以及染色体易位和其他重排。

HER2基因是癌症精准医疗的首批治疗靶点之一,并且已经改变了HER2阳性乳腺癌的治疗。自从发现HER2基因扩增并将其作为治疗靶点以来,测定拷贝数变异的技术在不断发展。利用最新的高通量拷贝数检测方法,人们可以更好地鉴定这些重要的基因变异,并深入了解它们与疾病的关系。

克服挑战

在检测全基因组的拷贝数变异(CNV)时,过去常用的方法是比较基因组杂交(CGH)和基因分型芯片。CGH利用长寡核苷酸探针来比较差异标记的靶点和参考DNA之间的荧光信号。基因分型芯片则不同,它利用短序列来捕获DNA片段,并根据不同的杂交强度来推导拷贝数。

虽然基于芯片的方法能够带来高效、灵敏且大规模的拷贝数分析,但它们也存在一些挑战,包括杂交噪音、分辨率低、基因组覆盖范围有限,以及难以检测新型或局灶性CNV。

随着新一代测序(NGS)平台的快速兴起,研究人员近来已经开发出基于NGS的方法来全面鉴定CNV。与芯片方法相比,NGS能够带来更高的覆盖度和分辨率、更准确的拷贝数评估,同时还能够检测其他类型的变异,包括小的变异和染色体易位。

从理论上讲,将NGS方法应用于CNV检测是非常简单的。“拷贝数改变的检测其实是一个read计数的应用。如果A基因经历了扩增,那么相对于基因组中的其他基因存在更多的拷贝。因此,在对扩增子进行测序时,A基因的测序read将会成比例地增加,”Thermo Fisher Scientific肿瘤学研发总监Seth Sadis解释道。

不过,主要的挑战在于重复性和可靠性,同时必须考虑变化和噪音。“既然这是一个计数应用,那么各种外部因素和内部因素都会引入变化,外部因素包括不同的PCR仪、不同批次的试剂、不同人员的处理,而内部因素则包括扩增子长度和GC含量,”Thermo Fisher Scientific的生物信息学家Jim Veitch解释说。

为了对拷贝数变化进行准确可靠的检测,必须对每个扩增子的read计数进行均一化,以便排除外部和内部因素引入的差异。同时,那些肿瘤含量有限的样本更具挑战性。于是,Thermo Fisher的Ion Torrent技术通过机器学习方法来去除扩增偏倚,对不同样本制备过程的read计数进行均一化。

新型工具

Sadis指出,Ion Torrent的拷贝数分析方案经过验证,适用于起始量低的样本,或者FFPE样本、细胞学标本或细针穿刺样本。此系统基于半导体测序平台,带来了快速的测序流程。同时,集成的软件流程为变异解释提供了解决方案,并自动将它们与公共数据库相关联。

日本山梨县中央医院的Yosuke Hirotsu最近就通过研究证实,Thermo Fisher Scientific新开发的Oncomine® BRCA1/2 Panel是一种快速准确的检测系统,能够同时检测致病变异和拷贝数改变。

Hirotsu对BRCA1和BRCA2基因中的生殖系突变很感兴趣,这些突变让患者容易患上遗传性乳腺癌和卵巢癌。致病性BRCA1/2变异的检测对癌症的预防和诊断至关重要。研究团队在147名乳腺癌和/或卵巢癌患者中检测到21种致病的生殖系变异,支持了这种产品在突变检测上的相关性。

应用爆炸

如今的应用正从简单的拷贝数检测转向其他类型的染色体改变,如染色体臂的扩增或缺失以及染色体碎裂,这些也与疾病息息相关。新工具可更精确地估计癌症样本中的肿瘤含量,从而对肿瘤内的拷贝数估计值进行均一化。

事实上,德国环境健康研究中心的Jan Smida及其同事最近利用Affymetrix CytoScan高密度芯片来评估160个骨肉瘤样本中的体细胞拷贝数改变。研究团队鉴定出常发生突变的基因或区域,并揭示出骨肉瘤特异的不稳定区域。他们的研究证实了疾病特异的基因组脆性区域,为深入研究骨肉瘤的复杂机理提供了新线索。

Veitch指出:“对癌症而言,挑战之一是检测与肿瘤抑制基因失活相关的拷贝数丢失。如果肿瘤抑制基因失活,其中一种机制就是失去了一部分,但许多突变都是新发的。”肿瘤抑制基因的失活方式可以有很多种,包括整个基因丢失,部分基因丢失,或序列改变导致功能丧失。了解这些过程何时发生以及如何发生,将是一项有趣的工作。

一直以来,拷贝数变异都与基因表达变化和疾病发展相关联。现在有了新型的芯片和NGS技术来获取这些知识,研究人员能够开展更深入的变异分析和筛选,并开拓一片更广阔的应用天地。

(作者:Jennifer Ellis / 生物通编译)

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