两大热门技术的碰撞：CRISPR + NGS（三）

CRISPR-Cas9技术的应用

【字体：大中小】 时间：2018年02月09日 来源：生物通

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　　CRISPR-Cas9技术的成功和快速采用在某种程度上要归功于新一代测序（NGS）的普及。NGS可用来检测基因组中的目标区域，验证目标的准确修饰，并检测任何脱靶效应。基因的表达和功能随后可以通过新一代RNA测序（RNA-Seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）来追踪。

II. 医学领域

CRISPR-Cas9基因编辑在疾病治疗上大有希望。与其他物种相同，基因编辑在人类细胞上的应用也包括生殖细胞和体细胞的层面。然而，生殖细胞的编辑引发安全和伦理方面的考虑。应科学界本身的要求，它已经暂停了。

最近在中国获批的1期临床试验是首次将改造过的免疫细胞注射到转移性非小细胞肺癌的患者中，这些患者对化疗或放疗都没有响应。这项研究将从10名参与者的血液中提取T细胞，并利用CRISPR-Cas9系统来敲除编码程序性死亡蛋白1（PD-1）的基因，这是免疫反应中的一个检查点。编辑后的细胞随后经过培养、扩增，并重新注入这些个体的血管中。在美国，NIH重组DNA咨询委员会（RAC）批准了一项类似的提案。这项研究将重点关注骨髓瘤、肉瘤和黑色素瘤的晚期患者，他们对标准疗法没有响应。除了敲除PD-1，研究人员也将插入编码NY-ESO-1受体的基因，此蛋白往往（只）在癌细胞上表达。研究团队还将敲除2个基因片段，以增强NY-ESO-1的特异性，这些片段编码主要T细胞受体的不同部分。

由于设计新颖，这两个试验的重点都放在安全性上（1期），将局限于少数患者。重要的是，这两种程序在将改造后的细胞重新注入患者之前，都将筛选脱靶编辑。

在鼠肝细胞上开展的体细胞基因编辑，首次证明了成年哺乳动物的体细胞编辑。在这项研究中，研究人员利用CRISPR-Cas9来校正与遗传性酪氨酸血症相关的突变，这代表了CRISPR-Cas9体细胞编辑在医学上的原理证明。然而，这项研究也强调了改善导入方法的必要性，以便提高基因校正的比例，并将转基因导入其他组织。基于这些理由，以及编辑效率和特异性的考虑，科学家建议谨慎将这种技术应用于医学领域。

应用示例：

Kataoka K., Shiraishi Y., Takeda Y., Sakata S., Matsumoto M., et al. Aberrant PD-L1 expression through 3’-UTR disruption in multiple cancers. Nature. 2016;534: 402-406.

PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸是癌症发展的一个重要机制。通过49例成人T细胞淋巴瘤（ATL）的全基因组测序，作者证明了免疫逃逸在部分程度上是通过破坏PD-L1编码基因3’端的结构变异来介导的。RNA-Seq表明，这些变异与异常PD-L1转录本的增加有关，后者因截短而稳定。他们利用CRISPR-Cas9技术，表明小鼠PD-L1基因3’未翻译区（3’-UTR）的破坏导致肿瘤细胞的免疫逃逸。这些结果证明PD-1的表达存在一种新的调控机制，并且表明3’-UTR可作为遗传标记，来检测通过PD-L1过表达而逃避肿瘤免疫力的癌症。

Illumina的技术：HiSeq 2000/2500 Sequencer

Yin H., Song C. Q., Dorkin J. R., Zhu L. J., Li Y., et al. Therapeutic genome editing by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system components in vivo. Nat Biotechnol. 2016;34: 328-333.

在这项研究中，作者利用脂质纳米颗粒导入Cas9 mRNA，并结合使用编码sgRNA和修复模板的腺相关病毒（AAV），其目的是在人遗传性酪氨酸血症的小鼠模型中诱导基因的修复。他们表明，通过校正致病性的剪接突变，该治疗产生了延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah）阳性的肝细胞。他们通过测序（GUIDE-Seq）对培养的肝细胞中的DSB进行基因组范围的无偏向鉴定，并结合靶向深度测序来监控脱靶效应，最终发现体内的脱靶率低。

Illumina的技术：Nextera XT、NextSeq® 500 Sequencer、MiSeq Sequencer

III. 农业和环境科学

CRISPR-Cas9在农业、食品科学和环境科学上也拥有巨大潜力。过去，作物和动物的基因编辑只适用于玉米和大豆等大宗商品。这种限制来自于转基因作物获批所必需的技术和监管上的障碍。CRISPR-Cas9技术的简单和低成本让科学家能够将其应用在不同物种上，如六倍体面包小麦、迷你猪和蘑菇。重要的是，一些经过改造的物种将不被现有的监管过程所覆盖。例如，最近改造的双孢蘑菇（Agaricus bisporus）不含外源基因，因此不需要受到美国农业部的监管。

CRISPR-Cas9技术也有望应用在环境科学中，特别是在基因驱动技术中——通过此过程让编辑后的基因在群体中传播，从而消除疾病。一些研究表明，基因驱动和CRISPR的结合使用可消除携带疾病的蚊子或蜱虫。然而，与人类生殖细胞编辑一样，这种方法已经被搁置，以便评估不可逆转或意想不到的潜在风险，并制定适当的法规。

应用示例：

Kistler K. E., Vosshall L. B. and Matthews B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Rep. 2015;11: 51-60.

在这项研究中，作者利用CRISPR-Cas9系统来编辑埃及伊蚊（Aedes aegypti）的基因组。通过RNA-DNA配对，此系统实现了高效的编辑，并获得了高存活率。作者利用深度测序来验证编辑的存在，且他们能够将单链和双链供体整合到基因组中。这些编辑实现了稳定的生殖细胞传递，让突变的等位基因从一代传到下一代。

Illumina的技术：MiSeq Sequencer