单分子光学图谱技术用于致病性结构变异（SV）临床诊断

在过去，运用二代测序技术对外显子进行测序，已经成功的应用于遗传疾病的临床检测中。然而现实中也只有30%的病例能够通过这一方式进行检测，这说明更多的遗传变异并不适用于这一方法。随着对遗传疾病研究的深入，以及基因组学研究技术的不断发展，研究人员们逐渐认识到， 结构变异（SV）对疾病的影响，远远超过了单碱基变异或者是小的插入/缺失变异所带来的影响。

Bionano Saphyr

基因有限公司代理的Bionano Genomics公司于2017年推出了新一代高通量单分子光学图谱检测系统Saphyr。自此之后，越来越多的目光投向了如何将Bionano技术用于由基因组结构变异引起的疾病的检测中。今天向大家分享的一篇文章，就是将Bionano单分子光学图谱技术用于直接检测杜兴氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）这一疾病。目的在于验证Bionano单分子光学图谱技术用于临床检测的有效性。

DMD的主要特征表现为骨骼肌功能逐渐丧失，心力衰竭和肺功能衰竭。作为一个X染色体连锁的隐性肌营养不良疾病，其在男性中的发病概率大约是1/5000。目前已有研究表明，DMD主要与dystrophin基因相关，而这一基因巨大，可转录为含有79个外显子，长度为14kb的mRNA。同时一些研究表明，与DMD相关的7000多个突变中，有超过86%的突变呈现为超过1个外显子的缺失。

实验方法

本文的作者选取了来自加州大学洛杉矶分校Duchenne Muscular Dystrophy研究中心的DMD患者作为研究队列。 这一队列中的所有先证者都已经被证实，在DMD基因中携带多个外显子的缺失或插入型突变，又或者是出现了大的倒位，引起了DMD开放阅读框的破坏。通过Bionano单分子光学图谱技术对这些队列进行检测，确认这一技术是否能够鉴定DMD先证者中存在的这些大的结构变异，并鉴定先证者母亲是否作为携带者的状态。

表1：用于本文研究的DMD队列

在实验过程中，作者从来自样本的新鲜血液，或是冰冻血液中抽提出高质量DNA，按照Bionano样本准备的workflow进行制备，并用Irys，或者是Saphyr系统进行单分子光学图谱检测。根据得到的数据，构建基因组物理图谱，对大的插入/缺失，易位、倒位进行鉴定。在分析得到相关的结构变异信息后，再通过qPCR的方式进行验证。

 
图1：Bionano单分子光学图谱检测workflow

实验结果

通过Bionano单分子光学图谱检测技术，作者鉴定到了DMD队列中所有已知的结构变异。并且，这一方法还能够鉴定到单外显子缺失以及多外显子缺失的情况。

同时，这一技术还能够成功用于杂合性插入/缺失的鉴定。经对CDMD1131（患者）和CDMD1132（母亲）基因组物理图谱的构建与分析，成功验证了CDMD1131患者的45-51号外显子缺失（约250kb）的导致疾病的大结构变异。并且，也发现这一结构变异杂合性存在于母亲的基因组中。

图2：CDMD1131的致病性大结构变异；同样的结构变异在CDMD1132（母亲）中杂合性存在。

在本次研究的队列中，已知CDMD1157被鉴定为46-51号外显子缺失而导致的DMD，而其母亲CDMD1158作为携带者，并没有相应的诊断结果。在本次的研究中，成功的构建了CDMD1157及CDMD1158的基因组物理图谱，鉴定到了CDMD1157中46-51号外显子长达185kb的缺失，并且也确认这一缺失并不存在于母亲CDMD1158的基因组中，说明这一突变为发生在CDMD1157中的de novo突变。

 
图3：同样的结构变异只存在于患者，并不存在于母亲的基因组中，说明患者出现的了de novo变异

对于像染色体芯片等常见的结构变异检测手段来说，由于倒位属于平衡性变异，对其的检测相对比较棘手。在本文涉及的研究队列中，有一名患者的通过临床表征已诊断为DMD，然而在基因组学分析方面，无论是PCR还是MLPA方法，都没有鉴定到致病的突变。而通过Bionano光学图谱技术，成功的鉴定到了长达5.1Mb的倒位，这一倒位干扰了与38号外显子有关的RNA剪切。这一结果后续也通过转录组学测序得到了验证。

 
图4：大型倒位变异

小结

这篇文章以经典的结构变异疾病DMD作为案例，运用Bionano单分子光学图谱技术成功的鉴定到了对队列中各个样本的结构变异情况。与以往常见的MLPA，染色体芯片等诊断技术相比，Bionano单分子光学图谱技术作为结构变异的新型检测手段具有许多优势：

1. Bionano单分子光学图谱技术，能够提供全基因组范围内的结构变异，并能够提供变异的顺序以及方向；
2. 能够检测诸如倒位、平衡易位等，大小为kb级别的平衡变异事件
3. 与二代测序技术相比，在大的结构变异检测方面，Bionano单分子光学图谱技术还能够提供更高的灵敏度。

参考文献
Barseghyan, Hayk, et al. "Next-generation mapping: a novel approach for detection of pathogenic structural variants with a potential utility in clinical diagnosis." Genome medicine 9.1 (2017): 90.

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