触手可得的无核酸酶水

【字体: 时间:2018年04月13日 来源:默克

编辑推荐:

  许多分子生物学应用都需要无核酸酶的玻璃器皿和试剂。用碳酸二乙酯(DEPC)化学处理产生无核酸酶的水长期以来一直是非常普遍的做法,但这一点方法存在几个缺点。而使用水纯化系统外加超滤终端滤器生产的纯化水,可以提供直接用于实验的无核酸酶超纯水。

关键词

核酸,核酸酶,RNA 酶,分子生物学,PCR,测序,基因编辑,超滤,超纯水,无核酸酶水

前言

核酸酶通过减切核酸骨架中的磷酸二酯键来降解 DNA 和 RNA。虽然有些核酸酶是有用的研究工具,但是通常科学家需要完整的生物样品信息用于 PCR,克隆,测序或基因编辑等应用。因此,研究核酸的科学家需要不含核酸酶的试剂和容器。水作为缓冲液和试剂的主要成分,也应该不含有核酸酶。可是,核酸酶在实验室中普遍存在,它们普遍存在于塑料制品和试剂中,甚至可能来自科学家自己(皮肤,唾液等)1 ,它们非常稳定,难以灭活2;因此,经常使用 DEPC 处理来消除它们。而超滤可以作为 DEPC 的替代方案生产无核酸酶水,处理方法方便和安全。

结果和讨论

在分子生物学中,使用核酸酶污染的试剂,特别是水可能导致结果的不一致性,甚至会损失有价值的样品。DEPC 是一种有效的非特异性 RNA 酶抑制剂,用于 RNase 灭活,且使用了多年3。用 DEPC 对溶液进行化学处理是一种非常有效的方法,但它存在几个缺点:

• 安全问题。DEPC 是一种疑似致癌物质,因为它可能与嘌呤发生反应,因此需要谨慎使用。此外,如果瓶子在室温中暴露于湿润 的空气中,DEPC 可能会水解,将会产生二氧化碳,这会增加潜在的危险。

• 时间和能源消耗。DEPC 和核酸酶之间的化学反应需要一定的时间,为了破坏 DEPC,需要对溶液高压灭菌。而高压灭菌需要消 耗大量的水和电。

• 引入可能影响实验的杂质。当 DEPC 在高压灭菌时会水解产生乙醇和二氧化碳(图 1)。乙醇可能与后续的实验步骤中的杂质反应,有可能产生不需要的副产物。此外,DEPC 对腺苷有很强的亲和力,即使只有痕量的 DEPC 保留在溶液中,它们也可能 与腺苷核苷酸发生反应(印迹,PCR 反应等)而导致实验结果不准确 1 ,痕量 DEPC 也可能与胺基和硫醇反应。

• 核酸酶不能从水中直接除去,而只能通过与 DEPC 的化学反应而失活。


Figure 1. Degradation of DEPC releases contaminants into water.

经过测试超滤可以作为产生无核酸酶水的替代方法。这个过程使用中空纤维根据其孔径分离污染物。一次性滤头内含 13 000 Da 标称分子量(NMWL)的聚砜超滤纤维(图 2)。


 Figure 2. Polysulfone hollow fiber used for ultrafiltration in the Biopak® cartridge.

图 3 显示当使用超滤过滤 RNA 酶溶液时,rRNA 保持了完整。同时,使用常规 DEPC 处理 RNase 溶液也能防止 rRNA 降解。作为对比,当 RNase 溶液未处理时,rRNA 被降解。这表明了使用超滤去除核糖核酸 RNA 酶与通过 DEPC 处理灭活 RNase 效果相当。

 
Figure 3. Gel electrophoresis of rRNA in water previously spiked with RNase and either DEPC-treated, ultrafiltered, or left untreated.

实验部分

用超纯水溶解 RNase A 并分成三份。方案是:

(1)用 DEPC 处理并高压灭菌 ;
(2)通过 Biopak 超滤终端进行处理 ;
(3)未处理。

将核糖体 RNA 加入到每个溶液中,孵育 20 分钟,然后用琼脂糖凝胶进行变性条件下的电泳。

结论

许多分子生物学应用都需要无核酸酶的水。与耗时又麻烦的 DEPC 处理方法不同,通过水纯化系统的超滤终端方式获得无核酸酶的水,是一种安全又便捷的方法。

这种方法对科研有很多好处:

• 按需,方便。当需要时,可以非常容易地生产新鲜纯化的无核酸酶的水。没有必要提前订购瓶装无核酸酶的水,或花时间制备 DEPC 水。
• 没有风险。不需要化学品操作。另外,由于没有添加化学物质到水中,所以没有其他试剂干扰的风险。
• 高纯度无核酸酶的水。超滤技术是从水中直接除去核酸酶而不是仅仅使他们灭活。因为过滤终端被设计成直接连接到水纯化系统®,因此可以非常方便的获得无核酸酶的超纯水。

References

1. R.E. Farrell, Jr., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization, Elsevier Acad. Press, (2005), 47-56.
2. B. L. Pasloske, Ribonuclease Inhibitors, Methods in Molecular Biology, vol. 160: Nuclease Methods and Protocols, 105-111.
3. B. Wolf, J. A. Lesnaw, M. E. Reichmann, A Mechanism of the Irreversible Inactivation of Bovine Pancreatic Ribonuclease by Diethylpyrocarbonate, European Journal of Biochemistry (1970). 13 (3): 519–25.
4. Diethyl pyrocarbonate – Product information sheet; https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_ Information_Sheet/d5758pis.pdf
5. S. Mabic and I. Kano, Impact of Purified Water Quality on Molecular Biology Experiments, Clin Chem Lab Med, (2003), 41(4):486–491.

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号