ATPlite化学发光检测方案:高通量细胞增殖/毒性检测[新品推荐]

【字体: 时间:2018年04月12日 来源:基因有限公司

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  ATP是所有细胞中均存在的具有代谢活性的物质,可作为活细胞的标志物。出现细胞坏死或者细胞凋亡等引起的细胞死亡的情况时,ATP的浓度急剧下降。ATP浓度监测是指示细胞损伤、细胞增殖以及细胞增殖抑制效果的良好指标。

荧光素酶(Luciferase)是一系列能催化荧光素(luciferin)氧化并产生生物冷光的氧化酶。荧光素酶在含有镁离子的情况下,可催化荧光素与ATP反应生成荧光素-AMP(中间体)和焦磷酸(PPi)。然后催化中间体氧化生成AMP、CO2和激发态的氧化荧光素。激发态的氧化荧光素在返回基态时发射出光。


图1:荧光素酶反应示意图

和其他荧光蛋白不同,luciferase的发光反应不需要额外的激发光,只要luciferase和底物接触就能产生荧光,发出的光子可以被光敏感元件测到,因此避免了因背景物质被激发而产生的背景荧光干扰。由于萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)比其他荧光素酶具有更高的发光效率,因此它现在已成为生命科学研究领域一种重要的检测工具。
 
ATP是所有细胞中均存在的具有代谢活性的物质,可作为活细胞的标志物。出现细胞坏死或者细胞凋亡等引起的细胞死亡的情况时,ATP的浓度急剧下降。ATP浓度监测是指示细胞损伤、细胞增殖以及细胞增殖抑制效果的良好指标。除此以外,也可以通过试剂盒里面所提供的ATP标准品测出实际ATP的量,用于细胞能量代谢研究。

ATPlite™和 ATPlite™ 1step (2D)

ATPlite™和 ATPlite™ 1step检测系统利用萤火虫荧光素酶检测ATP,进而检测哺乳动物细胞的增殖和细胞毒性,仅需加入细胞裂解液和底物溶液就可进行检测,比传统的 MTT/SRB 法更为方便和精确。

1. ATPlite™

这个检测系统的最主要优点是灵敏度高,线性好,操作简单,不需额外收集细胞等分离步骤,能快速获得结果。为了克服荧光素酶技术信号半衰期短这个缺陷,ATPlite™试剂中加入了可以稳定信号的物质,使信号半衰期长达5小时以上,因此不需要配备带有注射器的酶标仪。现在市面上部分ATP检测试剂盒普遍存在的一个问题是当中含有的裂解试剂不能非可逆地抑制ATP酶活性,而且含有影响荧光素酶活性的离散剂如TCA。ATPlite™ 试剂中的裂解液成分通过升高细胞培养液中的pH值来克服了这些问题,而之后加入的底物溶液(荧光素酶和荧光素)会下调pH值至适合反应的条件。

ATPlite™具有以下优点:

▪ 荧光信号寿命长:取决于细胞类型和培养基,半衰期高达5个小时。
▪ 快速:实验结果可以在15-25分钟内获得。
▪ 简单与可重复性:只需两步试剂添加步骤。
▪ 均质性实验:不用收集细胞和离心
▪ 灵敏:能够检测低至5 cells/100µL的细胞浓度。(数据得于CHO细胞和HL-60细胞)
▪ 线性范围大:=105(数据得于100µL培养基里面的CHO细胞和HL-60细胞)。


图1:ATPlite™的动态范围:使用 ATPLite™ 试剂对在 96 孔 板上培养的 CHO 细胞进行检测。结果显示获得了长期的稳定性和较宽的动态范围。

2. ATPlite™ 1step(一步法)

ATPlite™ 1step (一步法)是用于定量检测细胞活性的高灵敏、均质性的ATP一步法检测系统,信号半衰期为30分钟以上。对于一些高通量环境中需要进行流水线连续处理的系统来说,从试剂加入到信号读取的时间间隔相对较短,所以不需要很长的信号半衰期。加入试剂后30分钟荧光输出强度大约下降15%,具体荧光信号的下降程度取决于细胞类型,细胞数和培养基类型。对于96-孔板来说,最大可检测细胞数量为每孔50,000个,而384孔板为12,500个。这个试剂盒在最大细胞量下,30分钟内检测能有最强荧光信号。

ATPlite ™1step(一步法)具有以下优点:

▪ 无需洗涤:Mix & Measure匀相检测技术使检测步骤更少。
▪ 适用于96和384孔板。
▪ 荧光信号与细胞数呈线性关系:96孔板中每孔可检测高达50,000个细胞,384微孔板中每个孔可检测达高到12,500个细胞。
▪ 可用于连续操作体系:加入试剂盒混匀后的0-30分钟后都可检测荧光。
▪ 均质性:不需要收细胞和离心。
▪ 高灵敏度。
▪ 减少对酚红的依赖。
▪ 高强度光输出:试剂盒也可以用于灵敏度稍低的荧光酶标仪。
▪ 快速:不需要等荧光信号稳定的时间

图2-1:ATPlite™ 1step 的检测灵敏度和动态范围:将经过梯度稀释(2 倍)的 U937 细胞接种到 96 孔 CulturPlate上并加入 ATP 1step 试剂,孵育 10 分钟后进行发光检测。较少数量的细胞也能获得良好线性。


图2-2:ATPlite 1step™ 的稳定性:使用 ATPLite™ 1step 试剂盒对 RPMI-1640 10% FBS中培养的 CHO 细胞进行检测。结果显示,荧光信号具有长期的稳定性。

ATPlite™ 3D 和 ATPlite™ 1 step 3D

近年来,3D细胞培养引起了科研工作者的广泛关注。 ATPlite™ 3D或ATPlite™ 1步法的3D培养试剂盒是通过定量ATP含量进而检测细胞增殖和细胞毒性。专利创新的 ATPlite™ 3D 或 ATPlite™ 1 step 3D 试剂盒针对3D培养的特异性进行了优化,通过加入荧光素酶和D-lucuferin而对细胞中的ATP进行定量检测,从而达到测量3D培养的哺乳动物细胞毒性的目的。使用该试剂盒检测,直接将细胞裂解物/底物溶液加入到3D培养板中,孵育,裂解,然后将其转移到微孔板进行检测。

ATPlite™ 3D 和 ATPlite™ 1 step 3D具有以下优点:

▪ 寿命长的荧光信号:根据细胞种类和培养基的不同,信号半衰期可长达5个小时以上。
▪ 利用氢氧化钠来实现立体模型的完全裂解和ATP的彻底提取。
▪ 快速:40-45分钟内可获得结果。
▪ 操作简单,重复性高:生物发光检测优于荧光检测;ATPlite™ 3D 或 ATPlite™ 1 step 3D在裂解细胞前不需要转移细胞微球
▪ 均质性:不需要收集细胞和离心步骤。
▪ 广阔的线性范围:可检测200到5000个细胞立体模型的ATP。
▪ 方便的储存条件(2 - 8 °C)
▪ 不含DTT:不像大部分的荧光素酶检测试剂,lites的产品不含DTT,无臭味无毒性,不必在通风橱下操作

图3: ATPlite™ 1 step 3D与ATPlite™ 3D 的实验步骤比较。

ATPlite™ (2D与3D)与ATPlite™ 1 step (2D与3D)对比:

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