PNAS:一种在体监测基因转录的新方法

【字体: 时间:2018年04月17日 来源:NIBS

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  来自北京生命科学研究所NIBS的研究人员发表了题为“Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice”的文章,发明了一种在体监测基因转录的新方法,并首先将该方法用于长时间记录自由活动小鼠的生物钟基因。

  

来自北京生命科学研究所NIBS的研究人员发表了题为“Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice”的文章,发明了一种在体监测基因转录的新方法,并首先将该方法用于长时间记录自由活动小鼠的生物钟基因。

这一研究成果公布在4月2日的PNAS杂志上,同时这种新颖的实验方法详细的实验步骤及流程也已被视频实验方法学杂志J Vis Exp正式接收,并将在近期发表。这项研究由NIBS张二荃实验室和影像中心占成课题组合作完成,第一作者为博士生梅龙。

基因转录是生物学研究中的一个重要方向,基因的转录活性与动物和人的生理功能与行为密切相关。然而,现有的实验手段很难在正常生理和行为条件下研究基因转录的活性。

目前主要依靠Real-time PCR体外检测,原位杂交,western blotting,和Luciferase报告基因等方法测量基因转录水平,存在活体检测困难、实时性差、费时费力,实验误差大等缺点,且无法监测动物在不同行为条件下基因转录的活性。

两年前,张二荃博士和占成博士决定尝试利用荧光蛋白作为报告基因,建立新的基因转录活性报告系统。张二荃实验室的博士生梅龙经过不断的比较和筛选,选择了快速降解型黄色荧光蛋白dVenus作为报告基因,并成功构建了带有节律基因Cry1和Per2调控元件的报告载体。随后,在培养细胞系上成功实现了对Cry1和Per2基因转录活性的监测。

梅龙将Cry1和Per2的报告载体包装成腺相关病毒,通过微量注射到特定的脑区,成功表达在神经元中。针对节律研究时程长、稳定性要求高的特点,影像中心占成课题组设计并构建了一套高通量的在体基因监测系统,实现了同步记录动物行为与基因转录活性。

基于荧光报告系统的在体监测基因转录水平的新方法。(A)基于荧光(Fluorescence)报告基因的AAV病毒载体,在节律基因Cry1、Per2、Bmal1的启动子序列之后连上由lox2272和loxP序列间隔的反向dVenus荧光表达基因,在Cre重组酶的作用下dVenus荧光表达;(B)激发光经光纤导入到大脑,激发出的Venus荧光信号,通过在体基因监测系统采集信号,荧光信号的强弱表征基因转录活性;(C)Cry1基因6个月的稳定记录,图中灰色表示无灯光照明,白色表示有灯光照明。

研究人员利用该在体基因监测系统,首次实现了对小鼠脑内Cry1基因超过6个月以上的稳定记录;并结合Cre-loxP系统,研究了大脑视交叉上核SCN中VIP神经元的多个节律基因如何适应倒时差,发现仅8小时的时差提前会对Per2和Cry1基因的相位和振幅产生巨大的影响,这两个节律基因需要6天时间才能彻底恢复到之前水平。


8小时的时差提前对Per2和Cry1基因的相位和振幅的影响

2017年诺贝尔生理学或医学奖颁发给了发现“调控昼夜节律的分子机制”的三位科学家。生物节律基因的转录活性检测对开展生物节律研究非常重要,现有的技术手段活体检测困难、需要避光、实时性差,大大限制了节律调控机制的深入研究。

与原有的研究手段相比,新方法实现了多项技术突破:1)适合长时间连续记录(长达数月),2)时间分辨率高(每10分钟监测一次基因水平),3)实验动物可自由活动,4)光照是生物钟最主要的调节因素,新方法无需避光,可改变动物光照条件。更为重要的是,通过设计合适的病毒载体或者转基因小鼠,该方法将不仅仅限于生物节律研究,还可以用来研究各种生理条件下多种基因的表达和变化。

原文标题:

Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice



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