专家指导：如何在小鼠模型中研究癌症转移

　　

生物通报道：虽然癌症患者死亡的情况十之八九都是由于癌症转移造成的，但是这一方面却是研究得最少的领域，其中的原因在于癌症转移可以说是癌症研究中最棘手的问题之一。

近年来小鼠模型发展迅速，科学家们将癌细胞注入小鼠器官或血液中，或者通过基因工程改造，使其自发形成肿瘤，发生癌症转移，从而在小鼠中研究转移特性和人体癌变组织特征。

“这种肿瘤都具有各自的特点，颇具潜在的研究价值，”阿尔伯特爱因斯坦医学院的John Condeelis说。

然而，在许多动物模型中转移的频率却很低，并且能用于模拟转移过程的方法技术也只能重现一部分步骤。近期The Scientist通过专家解答了相关的一些问题，比如目前存在的挑战，如何挑选转移模型，以及如何利用新工具更加细致地研究癌症的转移。

细胞系和人类细胞移植

通过将细胞注入血液或器官中是模拟转移的最常见方法。细胞注射可以研究药物对转移的影响，以及细胞如何归位的调控机制。

麦克马斯特大学的癌症生物学家Sheila Singh为了防止出现癌细胞转移的研究偏差，将恶性细胞直接注入心脏，使它们能够进入整个动物中。然而，大多数癌症转移研究人员认为，最好的做法是将细胞注入到匹配的器官中，这样只要等着它们形成原发性肿瘤，然后转移到次级部位就行了。例如，转移性黑素瘤细胞系可以注射到小鼠的皮下皮层中，之后就会转移到小鼠的肺部。

John Condeelis和他的同事开发的这种技术可以在小鼠的肺部打开一个永久性的窗口，而且还不会影响小鼠的正常寿命。

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这种方法也存在小鼠转移频次低的问题——只有0.01％的癌细胞能脱离原发性肿瘤，在其它部分扩散出新的肿瘤细胞。但是许多商业上可获得的癌细胞系已经可以通过重复注射到原发部位，然后从转移部位收获高度转移的细胞了。

不过，Condeelis和Singh都警告说，几年甚至几十年的传代培养细胞可能引入遗传变化和污染，这可能会改变细胞的行为或身份。

一种替代方法就是从原始动物或人体组织中产生新的细胞系。“这些肿瘤往往更接近现实，”Condeelis说。Singh研究组经常这样做，但是“即使这样，我们的细胞也通常只培养少于一年的时间，不会延长到十年或十五年。”

Singh则更倾向于使用来自患者的肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft ，PDTX，生物通注）模型，也就是将人体细胞注入到动物中，这个过程需要IRB批准和生物安全培训，但她表示这还是很值得的，因为这样才可以深入了解人体转移癌细胞的特征。

“这就好像是利用小鼠的大脑作为肿瘤的孵化器，我们认为人体细胞更好。”

Singh研究小组从脑癌活检中采样人体肿瘤组织，每个癌症组织产生约500万至1000万个癌细胞。为了富集肿瘤起始细胞，研究人员一般选择能够在培养物中形成球体的干细胞，或者选择能表达称为CD133的肿瘤起始标记的细胞。

在去年发表的一项研究中，Singh研究小组将人类大脑转移起始细胞注入到了小鼠中，并使用RNA干扰发现了从肺到脑转移所需的两种基因（Acta Neuropathologica，134：923-40，2017）。

之后，他们分析了了原发性肺肿瘤的组织样本，发现其中一个基因：SPOCK1仅在肺癌最终扩散到脑部的患者样本中过表达，表明该基因可能是癌症转移的生物标志物。

PDTX受体小鼠一定是免疫受损的小鼠，这是为了防止它们出现免疫抗性。但这也限制了这种模型在分析通过激活T细胞起作用的免疫疗法药物方面的作用。

为了解决这个问题，Singh等人认为，可以尝试引入匹配的人类T细胞和肿瘤细胞一起，测试免疫治疗药物的疗效，然后转向更昂贵的具有人体免疫系统的人源化小鼠模型。

自发模型

对于Condeelis而言，小鼠基因被改变，自发产生肿瘤是研究癌症转移过程的金标准，这些模型有助于深入了解转移最早阶段，例如癌细胞与原发肿瘤分离并进入血管系统，以及微环境和免疫系统在促进转移中的作用。

Condeelis研究组就已经发现了巨噬细胞将癌细胞护送到血管并形成转移肿瘤微环境的结构中的重要功能（Cancer Discovery，5：932-43,2015）。之后巨噬细胞释放能引发血管内皮细胞之间连接松动的蛋白质，使得癌细胞可以容易地滑入脉管系统。

对于每种组织类型，目前已经有了几种商业上可以使用的基因诱导小鼠，其中一些小鼠更容易发生癌症转移。在同一类型原发性肿瘤的小鼠品系中，器官癌细胞也会出现不同的变化，因此选择能够显示感兴趣器官转移的细胞系很重要。

自发模型的缺点在于它们的肿瘤在转移前会杀死动物。这个问题可以通过设定一旦原发肿瘤达到400-500 mm³，就消除这些肿瘤来克服，这就和手术切除后出现转移的情况一样。进不进行手术，会影响肿瘤转移的时间：一些动物可能在一周内发生转移，而另一些则可能需要一个月。最终，可能需要结合多种方法来验证结果。 “最后，所有这些模型都是互证的，”Singh说。

成像检测

无论使用何种模型，成像在转移研究中都扮演着重要角色。无论是追踪从原发肿瘤中逃出的单个细胞，还是测量肿瘤体积，选择合适的工具都是至关重要的。

为了获得转移灶生长和扩散的成像，许多研究人员采用了癌症患者检测所采用的技术，包括计算机断层扫描（CT），磁共振成像（MRI），正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射断层扫描。

这种3D重建图像显示了利用CLARITY方法清除的小鼠脑内的星形胶质细胞（红色）和乳腺癌转移（黄色）。

美国印第安纳州圣母大学的肿瘤生物学家Siyuan Zhang说，为了计算分析转移性肿瘤的细节，许多研究人员需要收集含有肿瘤的器官切片。但是他在作为脑转移研究的博士后期间，发现这种方法费力不讨好，往往不准确。

目前其研究组采用的是组织清理技术，一种叫做CLARITY的技术，通过该技术人们可以对完整大脑进行化学、遗传学和光学分析，而这些研究此前只能在组织切片上进行。具体来说，CLARITY采用一种透明凝胶来替代大脑中的脂类，让大脑组织变得透明且可渗透。在此基础上，人们得以在细胞/分子水平上对完整大脑进行高分辨率成像。

近期，Zhang研究组还开发了一种称为spatial filtering-based background removal and multi-channel forest classifiers–based 3D reconstruction （SMART 3D）的技术，可以量化分析全脑成像的实验数据。

目前这一算法可以在GitHub上查询到，通过背景数据进行分割，研究人员能够解析肿瘤的特征，然后对其进行量化。例如，Zhang的研究小组用一种大脑细胞增殖标记来标记大脑，并将高增殖性转移性肿瘤的特征与那些不活跃生长的肿瘤相比较。他们发现，增殖速度与肿瘤大小无关，现在正在测试肿瘤增殖是否受环境变量影响，如接近血管。

活体呼吸数据

固定组织研究只能提供一个时间点发生情况的成像。Condeelis在研究癌细胞迁移进出血管系统时，研发出了能实时成像和跟踪乳腺组织，腹部器官和活体老鼠大脑中的癌细胞的新技术，而且为了研究乳腺癌的转移性扩散，他们针对活体动物成像中最大的挑战之一——肺展开了研究。

Condeelis说，在活体小鼠中对肺进行成像有几个障碍，“其中最重要的是肺非比寻常的机械运动。”小鼠每分钟呼吸120次，驱动了肺部形状和体积的相应变化。

为了解决这个问题，研究人员通常会进行一项终端手术，包括在动物的肋骨上开一个洞，并用真空吸引肺部打开一个窗口。成像后，必须牺牲动物，这意味着每个阶段的转换必须在不同的动物中成像。

Condeelis研究小组为了解决这个问题，与工程师和外科医生团队一起，研发了一种新技术，利用外科粘合剂将永久窗口固定在肺组织上。窗户的边缘附着在完整的肋骨上，但其余部分随肺部移动而移动。手术后，小鼠还能正常生活。

研究人员最开始利用这一模型研究了肿瘤细胞转移，他们发现这立即形成了肿瘤微环境的转移结构，该团队以前只在原发肿瘤周围的血管中见过，这表明即使在转移性肿瘤已经发展到临床可检测的大小之前，已经开始了扩散。

（Amanda B. Keener/生物通编译）