麻省总医院：miR-15b在体外和体内调节人骨肉瘤的多重耐药性

　　

骨肉瘤是儿童中最常见的原发性骨癌。骨肉瘤的标准治疗是手术和化疗。药物治疗包括多柔比星，甲氨蝶呤和顺铂的组合。但这些药物的功效受到多重耐药性（MDR）的阻碍。肉瘤中获得性MDR的机制尚不清楚。已提出几种在肿瘤细胞获得性MDR中起着重要作用的机制，包括编码ABC药物外排泵P-糖蛋白（Pgp）的MDR1（ABCB1）基因的过表达和提高有助于耐药性的凋亡阈值。通过靶向Pgp逆转MDR的策略已在不同的MDR模型系统和临床试验中被广泛研究，但结果有限。逆转耐药性仍然是成功治疗骨肉瘤的最大障碍之一。

研究表明，miRNA的失调可能导致化疗药物耐药性。miRNA可以影响肿瘤形成，维持，转移，凋亡和耐药性。许多研究观察到肿瘤中miRNA的失调。有研究证明miRNA参与了骨肉瘤的发病机制并在疾病诊断和治疗中具有发展潜力。miRNA在化疗耐药癌细胞及其亲代化疗药物中的表达显著不同。许多研究结果报道了miRNA在化疗耐药中的意义。miRNA在不同癌症化疗敏感性或化疗耐药性中发挥重要作用，但miRNA在骨肉瘤耐药性发展中的潜在作用很大程度上没有表征。

为了鉴定在骨肉瘤细胞耐药性发展中重要的miRNA，本研究利用miRNA芯片在两对骨肉瘤MDR细胞系中鉴定与MDR发展相关的miRNA，并在组织芯片（TMA）中检测了其与临床肿瘤样品的关联，分析了骨肉瘤MDR细胞系中显著改变的miRNA，并对其靶基因进行了鉴定。

材料：细胞：人骨肉瘤细胞系KHOS和耐药骨肉瘤细胞系KHOSMR，人骨肉瘤细胞系U-20S及其抗药性细胞系U-2OSMR 。组织：麻省总医院获得肉瘤组织库49位接受过骨肉瘤手术切除患者的冷冻组织样品。

本研究通过miRNA芯片技术在两对骨肉瘤MDR细胞系中筛选得到一个MDR发展相关的显著差异表达的miRNA——miR-15b。研究发现miR-15b与其亲代细胞系相比在KHOSMR和U-2OSMR细胞系中显著下调（P <0.01）。进一步研究发现Wee1是miR-15b的靶基因，通过检测miR-15b和Wee1在临床骨肉瘤样本的TMA中的表达情况，观察到miR-15b的转染抑制Wee1表达并部分逆转骨肉瘤细胞系中的MDR。Wee1是一种蛋白激酶，可调节G2点以响应DNA损伤。Wee1的过表达与各种癌症中的不良结果，复发和耐药性相关。全身性体内施用miR-15b模拟物使抗药性细胞对阿霉素敏感并诱导骨肉瘤MDR小鼠异种移植模型中的细胞死亡。临床上研究分析表明，miR-15b表达降低与患者生存率差有关。低miR-15b表达水平的骨肉瘤患者的生存时间显著低于高miR-15b表达水平的患者。这些结果表明，骨肉瘤中的MDR与miR-15b的下调相关，并且miR-15b重构可逆转骨肉瘤中的化疗耐药性。

图1 miR-15b转染至多重耐药骨肉瘤细胞可逆转多柔比星耐药
（A，B）KHOSMR和U-2OSMR细胞系中miR-15b表达对逆转耐药性的影响（P <0.05）。
（C，D）KHOSMR和U-2OSMR细胞系中，非特异性miRNA表达对逆转耐药性无影响。

图2 miR-15b转染至多重耐药性骨肉瘤细胞可抑制Wee1表达
（A，C）miR-15b转染至骨肉瘤耐药KHOSMR和U-2OSMR细胞抑制Wee1表达。
（B，D）用Image J分析图A和C的Western blots结果。

参考文献
Duan Z, Gao Y, Shen J, et al. miR‐15b modulates multidrug resistance in human osteosarcoma invitro and invivo[J]. Molecular Oncology, 2017, 11(2):151.

本研究中的miRNA芯片由联川生物提供

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