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CRISPR实验指南:检测CRISPR脱靶突变

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年04月04日 来源:生物通

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  要想检测CRISPR脱靶突变并不容易,但在过去几年中,研究人员提出了各种新方法。

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张锋实验室的一位研究生:Winston Yan的项目就是利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统的一个突变来敲除调控小鼠胆固醇的基因。“最终的目的是为治疗应用铺平道路,”Yan说,他最近完成了他的研究生工作,同时也第一次遇到CRISPR脱靶效应的问题。

CRISPR能帮助研究人员快速有效地对基因组进行有针对性的切割。它的特异性和易用性使其成为了颇具潜力的工具,可用于去除缺陷基因,治疗遗传疾病或癌症,编辑作物的基因组增加其产量或抗病性等。

然而,研究人员也首先必须克服CRISPR的主要限制之一:不仅在其目标位置切割,而且在具有相似序列的非预期位置上也会进行切割。这些脱靶切割可能发生在整个基因组中,导致产生损害细胞功能或直接杀死细胞的有害突变。

要想研发检测CRISPR脱靶突变的方法并不容易,但在过去几年中,研究人员提出了各种新方法。The Scientist杂志最新介绍了这些方法。

计算机模拟预测与无偏差检测

CRISPR编辑的特异性差异甚大,其精确性的一个关键在于导向RNA(gRNA),也就是指导Cas9核酸酶在基因组上特定位置切割的RNA序列。

“即使在同一个生物体内,这个导向RNA可以让你完全不要考虑脱靶突变的问题,而另一个导向RNA可能会带来多达150个脱靶点,”德国RWTH亚琛大学的博士研究生Julia Jansing说。

为此,研究人员发现或设计了比常用Cas9特异性更强的其他核酸酶,减少了非靶标位点的数量,比如Cpf1核酸酶和Cas9的高保真度版本。

但是,即使是优化后的导向RNA或核酸酶,也有可能导致基因组发生无意改变。预测CRISPR脱靶活动的一种方法,就是使用基于导向RNA序列鉴定可能的脱靶位点的计算算法,研究人员在基因组切割之后再进行靶向测序,检查这些预测的脱靶位点突变。

每种算法都有自己的秘诀,其结果并不总是一致的。“预测工具有好有坏,你会得到不多不少的可靠性,”Jansing说。

目前尚未进行过生物信息学预测工具的系统性比较,因此研究人员只能根据他们的偏好性,或者是否支持他们研究的基因组来选择一个。比如说,研究小鼠或人类的研究人员比从事番茄研究的有更多的工具可供选择。

对于基础研究应用,如制作突变细胞系,这种预测工具可能更为合适,因为它相对快速,简单且便宜,而且通常足以准确分析脱靶突变不太多的情况,并且不会混淆对实验结果的解释。

但是这样的预测远非万无一失。

“我们是把这种内在的偏差放在我们正在观察的地方,因为我们假设我们了解Cas9是如何切割的,”Yan说, “但是从许多不同的研究来说,情况并非如此。”另外,计算预测可能过于宽泛。“你永远不会在数千个站点上进行PCR来寻找少量的脱靶,”他补充道。

为了克服目前计算机预测的局限性,研究人员开发了多种体外和基于细胞的技术,全基因组范围无偏差检测CRISPR脱靶突变。这些方法在开发治疗药物,甚至在临床前研究中至关重要,因为这些方法可以检测罕见和不可预见的脱靶编辑,这些编辑可能会对患者产生潜在的有害影响,例如激活致癌基因。

哈佛大学医学院病理学教授Keith Joung说:“监管机构可能会要求进行某种全基因组脱靶分析。”

体外全基因组检测

当Cas9和其它类似的核酸酶切割基因组时,它们会导致双链断裂。大多数确定脱靶效应的体外试验采用Cas9或其它核酸酶切割无细胞基因组DNA,然后使用软件检测测序数据中的双链断裂。

这些检测方法通常非常敏感,可以检测到突变频率低于0.1%的脱靶位点,因此适用于大规模筛选,分析脱靶效应,或通过从患者中提取基因组DNA,用于临床分析。但是因为这些方法采用的是无细胞基因组DNA,所以无法预测细胞内发生的突变。

Digested genome sequencing( Digenome-seq )自2015年推出的一种体外检测方法,现在被应用于越来越多的研究中。它有简单的两步:体外Cas9切割,然后进行二代测序。

另外两种较新的方法: CIRCLE-Seq 和 SITE-Seq 则稍微复杂一点(测序前需富集核酸酶切割的基因组DNA),但灵敏度也更高。研究人员希望能提高这些方法的准确性和通量。

哈佛大学医学院病理学教授Keith Joung表示:“我认为从长远来看,体外研究将是一条可行之路,但现在还有待进一步完善”。

基于细胞的全基因组检测

这类检测脱靶的方法采用不同的技术,鉴定Cas9或其它核酸酶在细胞中裂解基因组DNA,并导致的双链断裂的位置。这种方法与体外方法相比的一个优点在于,它可以识别特定细胞类型和特定实验条件下的脱靶位点。

基于细胞的全基因组检测方法除了可以检测由CRISPR核酸酶产生的断裂,还可以检测内源性发生的双链断裂。其灵敏度根据所涉及细胞的特征而变化,包括培养和转染的容易程度,以及如何有效地修复双链断裂。

GUIDE-Seq是一种广泛使用且高度敏感的基于细胞的检测方法(生物通注),可以检测细胞群中发生频率为0.1%的脱靶位点。它的原理是通过小的双链寡核苷酸标记由Cas9或其他核酸酶产生的双链断裂,然后PCR扩增,并测序绘制出双链断裂 GUIDE-Seq的一个缺点是一些原代细胞难以用寡核苷酸转染。

线性扩增介导的高通量全基因组易位测序(LAM-HTGTS)检测的就不仅仅是断裂了,它能识别由这些断裂导致的基因组重排。

大多数由Cas9核酸酶切割的双链断裂能主动修复自身,但还有一些会融合到由其他双链断裂产生的末端,从而导致脱靶和断靶的染色体易位。LAM-HTGTS可以检测到这些易位,还有其它的一些脱靶编辑,包括它们对基因组不稳定性的影响。

“利用这种分析方法,你可以检测到一个生物过程的最终事件,”斯坦福大学分子遗传学家 Richard Frock说。

由瑞典卡罗林斯卡研究所的Magda Bienko和Nicola Crosetto、麻省理工学院的Zhang和Yan合作开发的BLISS(Breaks Labeling In Situ and Sequencing)方法则是通过生物化学方法标记固定细胞中的双链断裂,从而直接捕获原代细胞中的断裂数量。

这种检测的灵敏度取决于收获细胞的时间,而且不同的组织可能具有不同的最佳收获点。

“我认为我们的检测方法在临床上有很大的应用潜力,因为它可以检测自然环境中的断裂情况,”Crosetto说。


这些技术目前尚没有金标准,研究人员必须选择最适合他们研究的方法。Jansing说:“你具有哪种方法的设备和知识储备,这是一个问题。”如果需要研究的更彻底,可以选择多种方法。

这些方法都不需要测序前准备步骤的特殊试剂,因此通常只需几天到一周即可完成。根据样品的数量,分析的费用可能从几百到几千美元不等。

但是研究人员需要二代测序设备,测序的成本可能因样本数量和测序深度而出现差异。虽然目前测序成本下降了,但测序还是这些研究方法中最昂贵的部分。Jansing说,“绝对需要数千美元”才能完成这些测序,“这不是为了好玩而做的事情。”

采用这些分析方法还需要生物信息学的专业知识来分析测序数据。

“最大的挑战就生物信息学分析,因为没有现成的商业软件包来进行分析,”Joung说。他和他的合作者编写了自己的代码来分析GUIDE-Seq和CIRCLE-Seq结果。同样,Frock的实验室为他们的LAM-HTGTS也编写了自定义Perl脚本。他说:“每种方法都存在方法学上的不同,因此想要有一个通过途径来分析所有这些,并不容易。”

同时,Joung和他的同事们正在研究商业解决方案。他们成立了一家名为Beacon Genomics的公司(现名为Monitor Biotechnologies),计划收费提供GUIDE-Seq和CIRCLE-Seq服务。 Joung表示,他希望公司可以通过帮助研究人员外包二代测序和生物信息学分析步骤,方便进一步研究。

这种商业化的检测方法可以促进脱靶检测广泛应用,为改进CRISPR,使其在医学和生物技术应用中更安全铺平道路。 Yan说:“为研究人员提供一个几个小时内可以检测的工具,就像一个小型工具包一样。这太棒了。”


(生物通)


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