哈佛研发新技术：超精度测绘线粒体表面泛素化事件

哈佛医学院开发的一款新技术以前所未有的精度，呈现和分析了细胞如何去除受损线粒体。

　　

作为生命体的重要能源供给单位，像发电厂一样，线粒体无时无刻也在生产高剂量的有毒废物，因此，这些细胞器同样需要严格的质量控制和监管。

如果细胞在去除受损线粒体能力方面有缺陷，就会导致癌症和神经退行性疾病（如帕金斯），在这些病理条件下，电力不足的神经元极易受线粒体毒性影响。

《Molecular Cell》发文，一种新技术以前所未有的定量精确性分析了细胞如何通过“自噬”系统清理受损线粒体，该方法使研究人员首次有能力对干细胞来源的人类神经元内的天然过程展开研究，研究小组拍摄了迄今为止最清晰的、蛋白质水平的细胞自噬标记受损线粒体过程动态图，以及蛋白质修饰反应和随时间变化的峰度测量信息。

作者写道，结果为详细研究线粒体损伤、细胞死亡和疾病之间的联系奠定了基础，并建立了一种适应许多其他环境、揭示缺陷细胞通路的新技术方法。

 

线粒体质量控制分子报警系统涉及两种酶：蛋白激酶PINK1和泛素连接酶PARKIN。在正常情况下，健康的线粒体外表几乎不携带PINK1，一旦受损， PINK1开始积累，并将磷酸基团转移给PARKIN来激活它。被激活的PARKIN将泛素转移给各种不同蛋白质，为线粒体表面制造一个“泛素涂层”。当达到一定泛素阈值时，细胞自噬机制被触发启动，导致线粒体的降解。

PINK1和PARKIN突变在帕金斯病中多有研究，这类疾病涉及某些神经元的大量死亡和未折叠蛋白积累。尽管PINK1-PARKIN通路研究已经取得很大进展，但在很多关键特征方面我们仍知之甚少。

剥离涂层

已知泛素与其靶蛋白的特异性赖氨酸残基结合。但是，精确地确定哪些赖氨酸被修饰仍是这一领域的一大挑战，特别是线粒体表面上有十几个PARKIN靶标。此外，这些靶标的丰度也还不清楚，但其影响不容小觑。

通讯作者、细胞生物学系主任J. Wade Harper实验室与细胞生物学教授Steve Gygi实验室合作，建立了检测泛素相关蛋白质单赖氨酸残基的方法，文章一作Alban Ordureau和同事将其命名为PARKIN靶标平行反应监视器（PARKIN target-parallel reaction monitoring，Pt-PRM）。他们还创建了一个参考肽库，以方便科研工作者精确地测量受损线粒体的PARKIN靶标和单蛋白水平泛素化事件。

本质上，只需参考肽库，研究人员就能用一个质谱仪，同时“计数”特定情况下十几个线粒体表面蛋白的泛素化事件。

当结合实时测量后，该方法就能生成线粒体表面泛素化事件的“数字快照”，包括修饰的位点特异性和线粒体景观定量图像。

通过参考肽检测PINK1依赖的磷酸化事件，研究团队还将靶向磷酸化与泛素化统一起来。“这是迄今为止最详细的泛素通路分析之一，其他研究从没在这种复杂程度分析过这些过程，”Harper说。

技术快照

新技术可视化了线粒体表面精确的、绝对定量的蛋白质泛素化事件，与先前科学家们使用的非定量和不提供泛素化特异性位点的方法形成鲜明对比。

研究团队首次定量分析了人类干细胞诱导神经元内的天然泛素化相关事件，包括多巴胺能神经元。此前，这种帕金森症相关神经元的研究都建立在表达PARKIN的工程Hela细胞之上。

研究团队比较了两种细胞模型，发现了泛素化修饰事件在特异和时间等方面的相似性和差异性。他们发现了神经元上，而非HeLa细胞上的选择性泛素化的特定氨基酸残基。作者说，这些差异的生物学意义目前仍有待进一步研究。

一般来说，泛素化似乎随蛋白丰度增大，但本文作者发现了特定靶蛋白结构元件的选择性证据。“过去你必须运行几十个实验来获得相似或不准确的结果，如今我们还能更直观地分析神经元中的PARKIN磷酸化作用，”作者说道。

“泛素化是细胞用以去除受损或不需要的成分，从而维持自身健康和完整性的基本机制，”Harper说。“它不仅与线粒体有关，还与细菌、蛋白质聚集体和其他细胞器的降解有关。这项技术将被用来解释不同系统内的生物化学基础。”

LC3-II Enrichment Kit — 细胞自噬标志蛋白LC3-II检测新方法

原文检索：Dynamics of PARKIN-Dependent Mitochondrial Ubiquitylation in Induced Neurons and Model Systems Revealed by Digital Snapshot Proteomics

（生物通：伍松）