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如何减少活细胞成像时的光漂白?[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年05月10日 来源:生物通

摘要:

  在活细胞成像中,光漂白(photobleaching)是一个严重的问题。活细胞成像所使用的高强度光照可导致荧光团的荧光逐渐减弱,甚至消失。幸好,人们已经有了应对方案。如今,科学家采用多种措施来防止荧光蛋白和染料衰减,同时又不牺牲细胞健康。

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在活细胞成像中,光漂白(photobleaching)是一个严重的问题。活细胞成像所使用的高强度光照可导致荧光团的荧光逐渐减弱,甚至消失。幸好,人们已经有了应对方案。如今,科学家采用多种措施来防止荧光蛋白和染料衰减,同时又不牺牲细胞健康。

如何减少光漂白?

在开展活细胞成像时,如何减少光漂白的发生?通用电气医疗集团(GE Healthcare)的细胞分析应用专家Leanna Ferrand给出了如下建议。

▪ 使用合适的荧光团和荧光蛋白,它们的激发和发射波长应与荧光显微镜匹配。
▪ 在实验过程中,暴露在光照下的时间应尽可能短,光照强度尽可能低。
▪ 避免白白暴露在光照下,比如长时间通过目镜观察样品而不收集数据。
▪ 在设计实验时,全面考虑所有参数,收集到的信息只要能回答手头问题就够了,不要收集太多没用的信息。这些参数包括实验的总时间,成像的频率如何,以及每次使用的荧光通道数量等。

Oxyrase公司的营销部经理Lisa Stewart也提出了一些建议,包括在扫描设置时,最好采用中性密度(neutral-density)滤光片来减少光照,以及在各个应用中选择光稳定性最好的染料。

减少光漂白的试剂

目前,不少公司已经推出了一些有效的荧光保护剂,可以延缓荧光淬灭的时间。有些试剂是专门为活细胞成像而设计的,有助于活细胞成像研究。根据现有的几种光漂白假说,抗淬灭剂主要针对氧自由基的损伤作用。

据Vector Laboratories的营销总监Melissa Rebar博士介绍,一些平常多用于固定细胞的抗淬灭剂不能用于活细胞成像,因为它们与活细胞不兼容。

Vector Laboratories的VectaCell™ Trolox Antifade Reagent for Live Cell Imaging就是一种抗淬灭添加剂,可以在活细胞成像时保留和延长荧光信号的寿命。与载玻片上的免疫荧光信号一样,活细胞中的荧光蛋白或细胞染料也容易发生光漂白。

VectaCell Trolox抗淬灭剂是水溶性维生素E的一种稳定配方。它的抗光漂白和抗闪烁性质是Trolox及其氧化形式Trolox quinone共同作用的结果。这个氧化还原系统能够有效地对抗不同的活性氧物质,如单线态氧、超氧阴离子或过氧化氢。Rebar指出,研究已证明Trolox对多种细胞具有保护作用,且细胞毒性低。

既然VectaCell Trolox抗淬灭剂是一种抗氧化剂,那么它在成像介质中的最佳工作浓度就要取决于细胞类型以及细胞对缺氧的耐受程度。用户也许需要进行一些优化。

Oxyrase公司减少光漂白和光损伤的方法是基于其独特的除氧技术。OxyFluor™是一种来自大肠杆菌质膜的酶制剂。据该公司介绍,这些酶通过去除样品中的氧气和自由基来减少活细胞荧光成像应用中的光漂白和光损伤,同时不影响细胞内功能。

即使在高强度光照下,OxyFluor™仍能保留荧光标记的目标分子的信号,用于长时间的成像和分析。据Lisa Stewart介绍,采用标准的延时成像操作曝光120次后,使用OxyFluor™处理的样品比未处理细胞的亮度高出20%以上,让您有更多的时间从成像实验中收集数据。OxyFluor™可以添加到任何适合荧光成像的细胞培养基或缓冲液中,对细胞活力和增殖影响极小。

此外,OxyFluor™保留了荧光蛋白、MitoTracker染料等荧光探针和Hoescht 33342等复染剂的信号,让您可以延长成像时间,并获得更准确的结果。对于活细胞荧光成像中经常使用的大多数荧光试剂,它也提供了抗淬灭保护,包括绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、LysoTracker®和CellTracker™。

赛默飞世尔科技也提供活细胞成像的抗淬灭剂,那就是Prolong™ Live Antifade Reagent。它是基于Oxyrase的抗氧化技术。据介绍,ProLong Live 抗淬灭剂可以保护活细胞中多种荧光基团的信号。

您可通过直接向活细胞成像培养基中添加ProLong Live 抗淬灭剂,以减少光漂白效应,延长细胞成像时间。使用ProLong Live 抗淬灭剂后,您可在信号水平降低至50%之前最多延长20%的成像时间,从而观察到更多更详尽的细胞过程。

了解赛默飞的Prolong Live抗淬灭剂及更多抗淬灭剂

无论是采取预防措施,或采用抗淬灭剂,只要您提早规划,就能在更长的时间内尽情成像,避免光漂白的发生,同时让细胞维持健康状态。

(作者:Tamlyn Oliver / 生物通编译)

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