北大青年教授连发Cell,Nature子刊文章:新型基因编码的多巴胺荧光探针

【字体: 时间:2018年07月16日 来源:生物通

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  来自北京大学生命科学学院的李毓龙研究组近期接连在Cell,Nature Biotechnolog杂志发表文章,分别报道了新型基因编码的多巴胺荧光探针,和新型乙酰胆碱荧光探针的最新成果。

  

来自北京大学生命科学学院的李毓龙研究组近期接连在Cell,Nature Biotechnolog杂志发表文章,分别报道了新型基因编码的多巴胺荧光探针,和新型乙酰胆碱荧光探针的最新成果。

基于G蛋白偶联受体的多巴胺探针

在“A genetically-encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice”这篇文章中,李毓龙研究组开发了新型、可基因编码的多巴胺荧光探针,并将其应用在果蝇、斑马鱼和小鼠中检测内源多巴胺动态变化。该探针将成为研究多巴胺相关神经环路的重要工具。

多巴胺是一种重要的单胺类神经递质。在中枢神经系统中调控了一系列关键的神经功能,包括学1、奖赏、注意力和运动控制等。大脑中多巴胺失调会导致精神疾病或神经退行性疾病,如多动症、精神分裂症、帕金森氏病等。此外,多巴胺相关的神经环路还是成瘾药物如可卡因等的作用靶点。

为更好地研究多巴胺在生理和病理过程中起到的作用,研究人员需要实时检测活体内特定脑区的多巴胺信号变化,然而现有的检测手段并不能满足研究人员的需求。

为了解决这个问题,李毓龙研究组开发出了可基因编码的多巴胺探针(GRABDA),将对结构变化敏感的荧光蛋白(cpEGFP)嵌入人源多巴胺受体,使多巴胺这一化学信号转化为荧光信号,结合现有的成像技术,即可实时监测多巴胺浓度的动态变化情况。李毓龙研究组对探针进行了全方位的优化,使其具有极高的分子特异性和时空分辨率。此外,他们还开发出了具有高/低亲和力的两种版本的探针(分别命名为DA1h和DA1m),适用于多巴胺释放量不同的脑区。

由于该探针具有可基因编码的特性,李毓龙研究组通过转染、病毒注射以及构建转基因动物等手段,将探针表达在细胞、小鼠脑片或者活体果蝇、斑马鱼、小鼠中。实验结果表明,长时间表达该探针对模式生物的生长状态无明显影响。利用该探针,他们检测到了电刺激小鼠脑片引发的多巴胺释放,并在活体果蝇、斑马鱼和小鼠的大脑中检测到了与嗅觉刺激、视觉刺激、学习记忆、交配行为相关的多巴胺信号变化。

文章的第一作者为孙芳妙、曾健智、井淼。

乙酰胆碱探针在培养细胞中表现出对乙酰胆碱特异的荧光响应

第二篇文章“A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies”,则首次成功开发了灵敏、特异、可遗传编码的乙酰胆碱荧光探针,并成功地在不同生物体系中实时检测内源乙酰胆碱信号,为理解乙酰胆碱在生理和病理条件下的功能提供了重要的工具。

乙酰胆碱是研究史上第一个被鉴定的神经递质,其相关研究推动了神经递质和突触传递的概念的建立。目前人们已经对乙酰胆碱能神经元在外周神经系统(尤其是神经肌肉接点)的功能有了较为明确的阐述,但对其在中枢神经系统中的结构和功能的认识仍存在较大争议5。由于乙酰胆碱能神经元在皮层等区域的广泛投射,传统研究认为乙酰胆碱在大脑中作为广谱的神经调质,在多个脑区起到均一化的作用,如调节觉醒等生理功能。

然而,随着近年来神经环路研究的推动,乙酰胆碱能神经元参与的神经环路与学习记忆、注意、奖赏等行为的相关性被逐渐解析,并且其功能多呈现区域特异性甚至神经元特异性的功能调节。与此相对,在多种复杂神经疾病如成瘾、阿兹海默症中都伴随着特定脑区胆碱能信息传递的异常。子曰:“工欲善其事,必先利其器”。进一步的了解乙酰胆碱的生理功能及其在疾病中的贡献需要合适的方法,能够细胞特异性且实时灵敏的对乙酰胆碱在特定行为中的动态变化进行追踪。

与其从头设计,不如借鉴大自然的鬼斧神工。该研究首次通过对于神经递质特异的G蛋白偶联受体(GPCR)进行改造,通过在特定位置嵌入循环重排的荧光蛋白,将受体在被神经递质激活后的构象变化转变为荧光蛋白荧光信号的变化,进而反映对应神经递质的浓度变化。

通过对于乙酰胆碱受体的改造以及一系列突变筛选和优化,该研究获得对于乙酰胆碱具有灵敏光学响应的荧光探针,其对于生理浓度乙酰胆碱具有高信噪比的光学信号变化,并且具有亚秒级的反应速度以及良好的分子特异性,可实现时空特异的对于乙酰胆碱信号的精确指征。

在进一步工作中,该研究应用新开发的乙酰胆碱探针,在小鼠的多个脑区的急性脑片体系中成功检测了内源的乙酰胆碱释放,并且阐明了乙酰胆碱释放如何受到突触前神经元活性的调节,以及其在生理情况下的空间作用范围,为该领域长久以来的争论提供了直接的实验证据。

同时,应用果蝇和小鼠为模式动物,该研究成功实现了在活体果蝇的嗅觉系统中检测内源乙酰胆碱对嗅觉信息的编码,以及在小鼠视觉皮层神经元乙酰胆碱在注意性视觉刺激时的动态变化。这一系列工作为了解乙酰胆碱在不同生理情况下的释放及其功能提供了良好的范例。

文章的通讯作者为北京大学生命科学学院李毓龙研究员与弗吉尼亚大学医学院朱骏教授,第一作者为井淼、张鹏博士。

去年,李毓龙曾收到了来自美国“脑计划”的通知——他与另外两位学者共同获得美国“脑计划”为期三年的经费支持。该资助项目旨在开发基于G蛋白偶联受体的基因编码荧光探针,并利用新型的成像手段探索神经网络形成、维持及调控的机制。

原文标题:

A genetically-encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30845-6

A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies

https://www.nature.com/articles/nbt.4184


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