轰动科学界的LASSO克隆技术,了解一下[创新技巧]

【字体: 时间:2018年08月16日 来源:生物通

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  LASSO探针是单链的DNA片段,主要由三部分组成,包括与DNA目标互补的连接臂和延伸臂,以及两条臂之间长的接头序列。顾名思义,它就像一个套索,套住了目标基因。

克隆整个微生物组,这似乎是一个很大胆却又难以实现的想法。当Lorenzo Tosi博士向他的导师 – 哈佛医学院附属麻省总医院的助理教授Biju Parekkadan提出这个概念时, Parekkadan博士立即表现出极大的兴趣。

“一直以来,我都对开发生物学文库很感兴趣。不过,当我们真正开始克隆这种复杂的DNA混合物时,克隆较大的开放阅读框(ORF)显然是最先遇到的技术难题。于是,我们放慢节奏,试图先跨过这个障碍,”Parekkadan博士说。

他们开发的解决方案于2017年6月在《Nature Biomedical Engineering》杂志上发表,立即引起了科学界的极大关注。这种名为LASSO(long-adapter single-strand oligonucleotide,长接头单链寡核苷酸)的探针能够一次捕获数千个DNA碱基对。

LASSO探针是单链的DNA片段,主要由三部分组成,包括与DNA目标互补的连接臂和延伸臂,以及两条臂之间长的接头序列。顾名思义,它就像一个套索,套住了目标基因。

它的克隆效率也让科学界震惊。以往人们只能一次克隆一个基因,而LASSO探针能够克隆数千个片段。“由于连接臂和延伸臂在反应过程中始终在一起,故同一反应管中可实现高度多重的分析,因此可以最低的成本同时合成数千个探针,”Tosi博士解释。

与捕获DNA序列的传统技术 – 分子倒置探针(MIP)相比,LASSO探针显然更加高效。MIP通常可捕获长度为200个碱基对的序列。较长的MIP可捕获长达500个碱基对的片段,不过这种方法需要对每个探针进行独立的反应,严重限制了扩展能力。

在研究人员开展的概念验证研究中,一组LASSO探针能够同时捕获大肠杆菌K12品系的3,000多个DNA片段,它们含有大约4,000个注释的ORF,大小从200个碱基对到近5,000个碱基对不等。

如今,这个项目正在向着更高的目标努力。Tosi博士、Parekkadan博士以及约翰霍普金斯大学的病理学助理教授H. Benjamin Larman博士在申请重点技术开发奖,希望将LASSO探针研究提升到一个新的水平。

Parekkadan博士表示:“一个关键的因素是改善计算方面的问题。为了设计这些探针,我们建立了一种计算算法,能够帮助我们选择基因组中的目标,然后开发出短的前体探针,它们是构建最终的LASSO探针的原材料。现在,我们正在改进这些探针的设计,使其更加有效,并且最大限度地减少特定目标所需的探针数量。”

捕获人类基因

与此同时,研究团队还计划扩展这个平台。尽管之前的概念验证研究主要是针对细菌,具体来说是大肠杆菌K12品系,但他们也开始研究如何捕获人类基因,以及基因组的非编码区。

“针对这些不同目标,探针设计也是全新的,”Parekkadan博士说。“还有一个问题是:人类基因组远比细菌基因组复杂。当我们将实际的探针库与DNA样本混合时,这需要我们更深入地了解捕获反应,从而优化人类基因组的反应。”关于如何优化反应的细节,他们将在未来的文章中介绍。

在等待主要资助机构的一大笔资助的同时,这个研究团队必须尽可能地做出选择,以回应他们自最初发表研究成果以来收到的许多合作请求。

“尽管我们还没有与已经联系过的所有合作者合作,但我们一直支持共享我们的方案与试剂,让其他研究人员能够自行调整这项技术,”Larman博士说。“我们目前正在尝试开发一个更详细的实验方案和故障排查方法,让整个科学界都可以使用,并希望在一年内将其提交给《Nature Protocols》。”

研究人员仍在开展实验,看看LASSO探针能够捕获的范围到底有多大。“我们是否能设计探针,使其跨越基因组上的重要区域,以便人们对短读长难以测序的基因组区域进行研究?”Parekkadan博士谈道。

“这些区域通常含有许多重复片段,因此,如果你尝试捕获一小部分,然后进行比对,那么你根本无法比对,因为它们看上去都很像。而这些区域往往是突变的热点,因此不能掉以轻心,”他说。

LASSO也特别适合基因组中某些核苷酸含量特别高的区域,根据过往经验,捕获探针通常难以设计。Parekkadan博士说:“我们可以包裹整个区域,从而最大限度地减少这些含量很高的基因组区域的问题。我们希望通过适当的资源进行大量的开发。拥有一支专注的团队对实现这一目标至关重要。”

(作者:Gina Shaw / 生物通编译)

相关文献

Lorenzo Tosi, Viswanadham Sridhara, Yunlong Yang, et al. Long-adapter single-strand oligonucleotide probes for the massively multiplexed cloning of kilobase genome regions. Nature Biomedical Engineering (2017) doi:10.1038/s41551-017-009

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